鱼类肌肉生长抑素MSTN基因克隆及其基因打靶载体构建

摘要

一种鱼类肌肉生长抑素MSTN基因及其基因打靶载体，它的方法是分离克隆了花鲈MSTN基因，其全长为4873bp，包括3个外显子，2个内含子，5’调控序列和非翻译区以及3’非翻译区。根据测定出的花鲈MSTN基因序列，设计引物，扩增得到该基因的一个3.2KB的长片段和一个1.5KB的短片段，将这两个片段依次连接到pBSII⁺KS载体上，获得重组载体p+MSTN3.2+MSTN1.5，然后将正选择标记基因neo片段连接到上述MSTN基因长片段和短片段的中间，形成p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的重组载体；最后将负选择标记基因SVTK－tk片段连接到上述长片段的侧翼，最后获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo+tk的基因打靶载体。本发明克隆了鱼类MSTN全长基因，并首次构建了鱼类MSTN基因打靶载体，可用于各种鱼类MSTN基因克隆及基因打靶载体的构建，在鱼类基因工程育种上具有重要应用价值。

主权项

1、一种鱼类肌肉生长抑素MSTN基因的克隆，其特征在于它的克隆方法，包括：1、基因组DNA序列的获得，2、蛋白氨基酸序列推测和分析，3、基因组结构的分析；1)、基因组DNA序列的获得：用DNAStar软件对GenBank中其它几种鱼类的cDNA序列和DNA序列比对，根据其保守性很高的区域设计了三对简并引物，扩增并获得了花鲈整个MSTN基因组编码区序列，再通过已获得的花鲈MSTN序列，设计特异引物，通过基因组步移技术扩增出花鲈MSTN基因的5’和3’非编码序列，得到了全长的基因组序列；2)、蛋白氨基酸序列的推测和分析：根据外显子和内含子交界处的特征GT...AG，分析基因各外显子和内含子位置，用Ed it Seq软件分析ORF阅读框和推测蛋白质序列，用BioEdit软件对蛋白质序列进行比对分析；将推测的蛋白质序列与美国GENBANK序列数据库中其他物种的MSTN蛋白序列进行比对，用BLASTX程序算出同源性；3)、基因组结构的分析：将基因组DNA序列和蛋白序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，结构分析表明该基因组DNA全长4873bp，包括长度分别为378bp、366bp、381bp的三个外显子，长度分别为454bp和758bp的二个内含子及1170bp的5’非翻译区和1366bp的3’非翻译区；在5’非翻译区上发现了一个TATA框和7个肌肉特异性的E框。