一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，该法通过在酵母细胞中进行胞内表达或者分泌表达LT或LTB。在真核酵母细胞中外源表达LT及其突变体或其亚单位，能够大幅提高其表达水平。本发明构建了多拷贝的LT或LTB亚基表达盒，增加了LT或LTB在酵母中的基因剂量，同时将LT或LTB基因重组在毕赤酵母表达载体的强启动子醇脱氢酶(AOX)启动子之后，由甲醇诱导外源蛋白在酵母细胞中高表达，最终提高了LT及其突变体或LTB在酵母细胞中的表达水平，使得下游纯化更简单，临床使用更安全。本发明生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产粘膜佐剂及其临床应用具有重要的现实意义。

主权项

1.一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法，该方法采用下述顺序的步骤：(1)在酵母细胞中进行胞内表达LT或LTB将LT的两个亚基A和B的基因通过PCR扩增和酶切分别重组到酵母细胞的表达载体pAO815上，形成重组表达载体LTA/pAO815和LTB/pAO815，这两个重组质粒经体外重组法构建包含10拷贝LTB和2拷贝LTA的杂合重组表达载体或10拷贝LTB的重组表达载体；多拷贝重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达；收集并破碎酵母细胞，经亲和层析纯化就获得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性；(2)在酵母细胞中分泌表达LT或LTBLT的A和B两个亚基的基因通过PCR扩增和双酶切后重组到分泌信号肽α因子基因的下游，构建成融合基因αLTA和αLTB，再经酶切后重组到酵母表达载体pAO815上，通过体外重组法在pAO815上构建含10拷贝αLTB和2拷贝αLTA杂合重组表达载体或10拷贝αLTB重组表达载体，多拷贝重组载体线性化后电转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基筛选酵母转化子，PCR扩增确认转化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母转化子进一步液体发酵并用甲醇诱导表达；培养上清超滤浓缩后亲和层析纯化即获得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鉴定LT和LTB的分子量和免疫原性。