| 主权项 |
1.一种增幅核酸序列用或大量制造核酸用之方法, 其特征包含以下步骤: (a)将作为模板之核酸、去氧核醣核三磷酸、具 有股置换活性之DNA聚合、至少1种类之引子以及 会切断由此引子所生成之加长链的核醣核酸内切 加以混合以制备反应混合物之步骤;在此处之该 引子系与作为模板之核酸的硷基序列实质上互补, 其含有去氧核醣核酸以及核醣核酸,且该核醣核酸 为配置于该引子的3'末端或3'末端侧之嵌合寡核 酸,在此,该核醣核酸之长度为1mer~15mer;以及 (b)以可进行以下反应之条件下,使反应产物可生成 之充分时间,以20~80℃之等温条件下孵育反应混合 物之步骤:引子对模板核酸之专一性连结反应、利 用DNA聚合进行之加长链合成反应及股置换反应 、藉由核醣核酸内切进行之加长链之切断反应 。 2.如申请专利范围第1项之方法,其中该含有核醣核 酸之部位系可利用核醣核酸内切切断。 3.如申请专利范围第1项之方法,其中进一步使用含 有具有与模板核酸之硷基序列实质上相同之序列 的嵌合寡核酸引子之反应混合物。 4.一种核酸序列增幅用或大量制造核酸用之方法, 其特征包含以下步骤: (a)藉由将作为模板之核酸以与该核酸之硷基序列 实质地互补之至少1种类之引子及DNA聚合进行处 理,而合成与上述模板互补之引子加长链之步骤; 在此处之该引子为含有去氧核醣核酸以及核醣核 酸之嵌合寡核酸引子,该核醣核酸系配置于该引 子的3'末端或3'末端侧,在此,该核醣核酸之长度为1 mer~15mer; (b)将(a)步骤所得到之双股核酸引子的加长链之含 有核醣核酸之部位,以核醣核酸内切切断之步骤 ,以及 (c)由(b)步骤得到之引子的加长链所被切下来之双 股核酸之引子部分的3'末端开始,利用具有股置换 活性之DNA聚合,将与模板互补之核酸序列加长, 并进行股置换之步骤; 其中各步骤系可以20~80℃之等温条件下进行以下 反应之实施:引子对模板核酸之专一性连结反应、 利用DNA聚合进行之加长链合成反应及股置换反 应、藉由核醣核酸内切进行之加长链之切断反 应。 5.如申请专利范围第4项之方法,其中(b)步骤与(c)步 骤系连续地反复进行。 6.如申请专利范围第4项之方法,其系于步骤(b)中再 度利用含有再生之引子加长链的双股核酸,且其进 一步包含以下工程: (d)以(c)步骤所得到之游离之取代链作为模板,利用 与(a)步骤所使用之引子相异之至少1种引子,以及 DNA聚合共同处理,以合成与取代链互补之引子加 长链之步骤;在此所谓与(a)步骤所使用之引子相异 之引子系与取代链之硷基序列实质上互补且含有 去氧核醣核酸以及核醣核酸之嵌合寡核酸引子, 该核醣核酸系配置于该引子的3'末端或3'末端侧, 在此,该核醣核酸之长度为1mer~15mer; (e)将(d)步骤所得到之双股核酸引子的加长链之含 有核醣核酸之部位,以核醣核酸内切切断之步骤 ;以及 (f)由(e)步骤得到之引子的加长链所被切下来之双 股核酸之引子部分的3'末端开始,利用具有股置换 活性之DNA聚合,将该与模板互补之核酸序列加长 ,并进行股置换之步骤;且该包含再生之引子的加 长链之双股核酸系再度利用于(e)步骤之步骤。 7.如申请专利范围第1或4项之方法,其中使用具有 股置换活性之1种的DNA聚合进行。 8.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该核醣核 酸系因藉由核醣核酸内切之切断而配置。 9.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该DNA聚合 系指由获得自大肠菌之DNA聚合I的Klenow片段、 获得自史泰洛嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus)之5' →3'核酸外切缺失Bst DNA聚合以及获得自卡多 提那克斯杆菌(Bacillus caldotenax)5'→3'核酸外切缺 失Bca DNA聚合所构成之群组中所选择之DNA聚合 。 10.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该核醣核 酸内切系RNaseH。 11.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该嵌合寡 核酸引子系含有连续2个残基以上之核醣核酸。 12.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该嵌合寡 核酸引子系含有1个以上之修饰核醣核酸。 13.如申请专利范围第12项之方法,其中该嵌合寡核 酸引子系含有以硫原子取代结合于核醣核酸的 位置磷原子之氧原子之(-S)核醣核酸。 14.如申请专利范围第1或4项之方法,其中该模板核 酸系单股或双股DNA。 15.如申请专利范围第14项之方法,其中系于将作为 模板之双股DNA变成单股DNA之步骤后进行。 16.如申请专利范围第14项之方法,其中该模板核酸 系由RNA利用逆转录反应所得到之cDNA。 17.如申请专利范围第16项之方法,其中系于藉由以 RNA作为模板之逆转录反应合成cDNA之步骤后进行。 18.如申请专利范围第17项之方法,其中逆转录反应 用引子系由寡dT引子、随意(random)引子或者专一性 引子所构成之群组所选择者。 19.如申请专利范围第17项之方法,其中逆转录反应 用引子系嵌合寡核酸引子。 20.如申请专利范围第17项之方法,其中系使用具有 逆转录酵素活性之DNA聚合作为逆转录酵素。 21.如申请专利范围第17项之方法,其中逆转录反应 以及与模板互补之加长链之合成系藉由具有逆转 录酵素活性以及股置换活性之1种的DNA聚合进行 。 22.如申请专利范围第21项之方法,其中所使用之该 DNA聚合系获得自史泰洛嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus)之5'→3'核酸外切缺失Bst DNA聚合 或者获得自卡多提那克斯杆菌(Bacillus caldotenax) 之5'→3'核酸外切缺失Bca DNA聚合。 23.如申请专利范围第17项之方法,其中作为逆转录 反应之模板的RNA系于核酸增幅反应中所增幅之RNA 。 24.如申请专利范围第23项之方法,其中系于藉由以 RNA作为模板之核酸增幅反应增幅之RNA片段合成步 骤之后实施。 25.如申请专利范围第23项之方法,其中核酸增幅反 应系由转录增幅系统(TAS;transcription-based amplification system)法、自主序列复制(3SR;self-sustained sequence replication)法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)法、TMA(transcription-mediated amplification)法 或者Q复制法中任一者所选择者。 26.如申请专利范围第14项之方法,其中模板核酸系 利用核酸增幅反应所获得之DNA。 27.如申请专利范围第26项之方法,其中系于藉由以 DNA作为模板之核酸增幅反应的增幅DNA片段合成步 骤之后实施。 28.如申请专利范围第27项之方法,其中该核酸增幅 反应系由聚合链锁反应(PCR;polymerase chain reaction) 法、结合链锁反应(LCR;ligase chain reaction)法、SDA( strand displacement amplification)法之任一者所选择者。 29.如申请专利范围第26项之方法,其中核酸增幅反 应系使用随意(random)引子或简并(degenerate)引子所 进行者。 30.如申请专利范围第29项之方法,其中随意引子或 简并引子系至少在其3'末端或者3'末端侧具有随意 序列或简并序列之引子。 31.一种用于申请专利范围第1或4项之增幅核酸序 列用或大量制造核酸用之方法的嵌合寡核酸引 子,其系含有1个以上之修饰核醣核酸。 32.如申请专利范围第31项之嵌合寡核酸引子,其 中系含有以硫原子取代结合于核醣核三磷酸的 位置磷原子之氧原子之(-S)核醣核酸作为修饰 核醣核酸。 33.一种用于检测试剂中标的核酸之方法,其系包含 : (a)利用申请专利范围第1或4项之增幅核酸序列用 或大量制造核酸用之方法,将标的核酸增幅之步骤 ;以及 (b)检测(a)步骤所增幅之标的核酸之步骤。 34.如申请专利范围第33项中之方法,其系以可成为 消光状态之距离下所配置之2种类以上之萤光物质 ,检测利用所标志之核醣核酸(RNA)探针所增幅之标 的核酸。 35.一种用于申请专利范围第1、4或33项之方法之套 组,其特征系在包装型态中,含有: (a)具有股置换活性之DNA聚合; (b)核醣核酸内切;以及 (c)股置换反应用缓冲液。 36.如申请专利范围第35项之套组,其系含有指示有 关股置换反应中DNA聚合以及核酸内切之使用 之说明书。 37.如申请专利范围第35项之套组,其中含有由获得 自大肠菌之DNA聚合I的Klenow片段、获得自史泰洛 嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus)之5'→3'核酸外切 缺失Bst DNA聚合以及获得自卡多提那克斯杆菌 (Bacillus caldotenax)之5'→3'核酸外切缺失Bca DNA聚 合所构成之群组中所选择之DNA聚合作为DNA聚 合。 38.一种用于申请专利范围第35项之套组,其中含有 RNaseH作为核醣核酸内切。 39.一种用于申请专利范围第1、4或33项之方法之组 合物,其包含: (a)具有股置换活性之DNA聚合; (b)核醣核酸内切;以及 (c)股置换反应用缓冲液。 40.如申请专利范围第39项之组合物,其中含有由获 得自大肠菌之DNA聚合I的Klenow片段、获得自史泰 洛嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus)之5'→3'核酸外 切缺失Bst DNA聚合以及获得自卡多提那克斯杆 菌(Bacillus caldotenax)之5'→3'核酸外切缺失Bca DNA 聚合所构成之群组中所选择之DNA聚合作为DNA 聚合。 41.如申请专利范围第39项之组合物,其中含有RNaseH 作为核醣核酸内切。 42.一种将核酸于特定之区域上排列之核酸固定化 物质之制备方法,其系包含: (a)利用申请专利范围第1或4项之增幅核酸序列用 或大量制造核酸用之方法,将应该固定化之核酸增 幅之步骤;以及 (b)将(a)步骤所增幅之核酸,于载体上之特定区域上 排列并固定化之步骤。 43.如申请专利范围第42项之将核酸于特定之区域 上排列之核酸固定化物质之制备方法,其中将实质 上不含其互补链之单股核酸加以增幅,并于特定之 区域上将其排列并固定化。 44.一种将藉由申请专利范围第42项之方法所制作 之核酸于特定之区域上排列之核酸固定化物质,其 特征系将单股核酸于特定之区域上排列并固定化 者。 45.如申请专利范围第44项之将核酸于特定之区域 上排列之核酸固定化物质,其中实质上不含其互补 链之单股核酸系于特定之区域上排列并固定化。 46.一种用以检测试剂中之标的核酸检测方法,其包 含: (a)由试剂制备可能包含标的核酸之核酸试剂之步 骤; (b)将该核酸试剂与申请专利范围第42项之方法所 制得之核酸固定化物质相接触之步骤; (c)检测与核酸固定化物质中之核酸杂合之该核酸 试剂中之标的核酸之步骤。 47.一种用以决定核酸之硷基序列之方法,其特征包 含将申请专利范围第1或4项之方法之核酸序列加 以增幅之步骤。 48.一种用以检测标的核酸之变异之方法,其特征包 含将申请专利范围第1或4项之方法之核酸序列加 以增幅之步骤。 图式简单说明: 图1:处理本发明中单股DNA之方法的一个例子之流 动图。图中,黑色圆系表示游离之DNA链为(6)之模板 DNA。 图2:系表示利用本发明之方法,于各种反应时间下, 经增幅之增幅DNA片段之洋菜琼脂凝胶电泳之结果 。 |
