降钙素原的制备方法

摘要

降钙素原(PCT)的制备方法属于医药和生物工程技术领域，涉及一种临床上可以快速准确反应炎症指标的多肽PCT的制备方法，发明采用PCT cDNA以基因工程方法制备含116个氨基酸残基的PCT。用PCR技术将表达PCT的目的基因扩增，纯化其产物，将纯化的PCR产物予BamH I与Hind III双酶切后定向插入经同样双酶切的pet41a，获得重组质粒，再将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经培养扩增，抽提纯化，镍柱收集目标峰，真空冷冻干燥。本发明方法获得的降钙素原得率高、成本低，可以为制备临床诊断试剂提供大量的原材料。

主权项

1、降钙素原(PCT)的制备方法，其特征在于下述步骤：(1)采用经组织培养的人甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)，经trizol裂解、抽提得到PCTmRNA；(2)将PCTmRNA逆转录得到PCT的cDNA，也可直接化学合成得到PCT的cDNA；(3)采用PCR技术将表达PCT的目的基因扩增，并纯化其产物；(4)将纯化的PCR产物于BamH I与Hind III双酶切后定向插入经同样双酶切的pet41a，获得重组质粒Pet41a+PCT；(5)将重组质粒Pet41a+PCT转化至大肠杆菌DH5a，经培养扩增，抽提纯化，测序分析，获测序正确的重组质粒；(6)将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)菌，在30℃，0.1mM IPTG条件下表达重组蛋白；(7)将表达重组蛋白的活化菌株接种到2-YT培养基恒温振荡培养，进行摇瓶实验，工程菌在发酵罐中高密度发酵，种子菌按5％比例接种，在低溶氧条件下诱导，放罐，离心得菌体；(8)将离心得到的菌体沉淀进行细胞裂解，洗涤出包涵体，溶解包涵体，过镍柱纯化；(9)通过免疫测定或生物活性测定检测降钙素原峰部分，得到纯化的降钙素原。