<SUP>15</SUP>N稳定性同位素标记L－谷氨酸的生产工艺

摘要

本发明涉及¹⁵N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，该工艺包括发酵菌株的选择、保藏斜面制备、活化斜面制备、种子培养、发酵培养基的配制、发酵工艺、分离提取等工艺步骤；本发明利用微生物直接发酵法生产，控制有机氮源添加量，直接添加生产因子，通过物理条件控制细胞膜通透性，并采用低糖流加工艺改善产酸率，这样可使¹⁵N原料得到有效利用，丰度下降不致于影响产品生产要求。

主权项

1.15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)发酵菌株的选择：用于L-谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、钝齿棒杆菌之一；(2)保藏斜面制备：将上述发酵菌株接种于斜面，29～37℃恒温培养8～20小时，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制备：将步骤(2)得到的保藏斜面接种于活化斜面，培养方法同步骤(2)；(4)种子培养：将步骤(3)得到的活化斜面菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在29～37℃下摇床培养8～20小时；(5)发酵培养基的配制：以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源；主要配方如下：碳源为葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL，无机氮源为尿素0.2～1g/dL，或者氨水、液氨、氯化铵、硫酸铵或硝酸铵按碳氮比100∶15～30，有机氮源为玉米浆、酵母膏、酪蛋白水解液或菌体水解液0～1mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dL，MgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dL，MnSO4.H2O 2～20mg/L，FeSO4.7H2O 2～20mg/L，维生素H 100～600μg/L，和维生素B1 50～1000μg/L；(6)发酵工艺将步骤(4)培养好的种子按体积比2～10％接种于已灭菌的装有步骤(5)所述发酵培养基的发酵摇瓶或发酵罐中开始发酵，其中：摇床发酵控制条件为：发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，摇床转速180～240r/min；在发酵液稀释20倍测定OD值净增0.2～0.6时，将温度升高到37～39℃，同时提高转速到260～350r/min；在对数生长早期8～16小时加入0～0.3mL/dL的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；发酵罐控制条件为：发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.01～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％饱和度，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡；在发酵液稀释40倍测定OD值净增0.2～0.6时，将温度升高到37～39℃，同时提高转速保证溶解氧在30～50％饱和度；在对数生长早期5～16小时加入0～0.3mL/dL的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；(7)分离提取将步骤(6)培养好的发酵液，通过发酵液预处理，即添加草酸除去金属离子，添加聚丙烯酰胺絮凝剂、加热除去蛋白和离心除菌体得到的上清液采用等电点沉淀和离子交换法分部提取得到15N稳定性同位素标记L-谷氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用活性炭脱色、乙醇低温结晶和真空干燥得到产品。