具有抑制血管生成及抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv－LDP－AE

摘要

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的强化融合蛋白Fv-LDP-AE，主要通过融合蛋白的基因工程构建和分子强化两条技术路线制备而成，融合蛋白Fv-LDP的基因全长1119bp，编码372个氨基酸，分子量为38.7kDa，它对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成，动物实验证实，其对小鼠移植性肝癌H22有非常显著的疗效，使用可耐受剂量，其抑瘤率可达95.9％(P＜0.001)，该强化融合蛋白显示了抗体靶向药物的小型化与高效化特点，可望成为一种用于临床治疗肿瘤的新型靶向药物。

主权项

1.一种高表达强化融合蛋白Fv-LDP-AE的制备方法，其特征在于所说方法采用DNA重组和分子强化两条技术路线，具体步骤如下：A.力达霉素辅基蛋白LDP与抗IV型胶原酶单链抗体scFv的融合基因构建；B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pEFL的构建，是用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和IV型胶原酶单链抗体scFv基因，将二者以编码一段柔性小肽的DNA序列相连构建成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同时在spacer区引入特异性酶切位点，克隆至高效表达的表达质粒pET-30a(+)，筛选获得重组表达质粒pEFL；C.融合蛋白Fv-LDP在大肠杆菌CAMS/FLDFP(保藏编号：CGMCCNo.0960)中的诱导表达，是将重组表达质粒pEFL转化入高效表达的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)starTM获得重组转化菌，经终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导培养4-6小时，获得包涵体形式的融合蛋白Fv-LDP，并进行条件优化获得最佳表达，其蛋白表达量为30％；D.融合蛋白Fv-LDP的亲和层析纯化与分离，是通过金属螯合亲和柱纯化融合蛋白Fv-LDP，将变性蛋白样品上柱，用1×Binding Buffer冲洗亲和柱，除去大部分杂蛋白，再用1×washing buffer洗涤层析柱，除去少部分杂蛋白，最后以1×Elute Buffer进行洗脱，收集洗脱组份获得纯化后的融合蛋白，再进行透析，复性，脱盐，冷冻干燥，于-70℃保存，用于制备功能性融合蛋白；E.强化融合蛋白Fv-LDP-AE的制备分离，是将纯化分离得到的融合蛋白Fv-LDP与5倍分子量经甲醇提取制备的力达霉素发色团活性型烯二炔AE，混合振摇，室温放置12小时进行分子强化，将混合液以PD-10柱层析分离，经A280nm紫外监测后，弃过量未反应的AE，获得强化融合蛋白Fv-LDP-AE。