一种高产量大规模质粒制备方法

摘要

本发明一种高产量大规模质粒制备方法，包括菌落培养与收集：原生质体制备：质粒的抽提纯化：用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；本工艺与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当，而产量却大幅度提高，每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15-23mg。第一次在上清中沉淀质粒使用20％的PEG₈₀₀₀而不使用异丙醇，并将沉淀加入18TE溶液溶解，加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低，与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法的相当。

主权项

1、一种高产量大规模质粒制备方法，包括以下步骤：1)菌落培养与收集：挑目的单菌落接种LB培养基，加入相应量抗性药物，至OD600≈0.6，取50ml倒入1000ml LB培养基中培养12-16小时左右，5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体；2)原生质体制备：细菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl、pH 8.0，吹打悬浮；冰浴3-5分钟；加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl、pH 8.0配制的新鲜溶菌酶液5mg/ml，冰浴5分钟；加入20ml预冷的0.25M EDTA、pH 8.0，冰浴5分钟；加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl、pH 8.0，37℃水浴5分钟；立即4℃，6000rpm，10分钟，弃上清；3)质粒的抽提纯化：将获得的原生质体沉淀，及时加入6ml 5倍由0.25M葡萄糖，75mM Tris-HCl，50mM EDTA pH 8.0配制的溶液I，吹打悬浮后，加入23ml蒸馏水，再加入0.6mg RNA酶A，37℃作用15分钟；加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml，37℃，再作用15分钟；加入30ml由0.2M NaOH，1％SDS配置的溶液，轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分，冰上放置5分钟；加入30ml冰预冷由60％ 5M KAC，11.5％冰醋酸配制的溶液，震摇混匀，冰浴5分钟；7500rpm，15分钟：①取上清暂保存；②对沉淀物加入25ml TE悬浮，加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，摇床震摇210-230rpm，再次悬浮消化至适当；8000rpm，离心10分钟，取上清；将①和②的上清，加入1/2体积20％的PEG8000溶于2.4M的NaCl溶液，冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜；12000g，离心5分钟或8000g，15分钟；弃上清，沉淀加入18ml TE溶解；加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；取上清，加入0.1体积3M NaAC、pH 5.2，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃后，4℃，30分钟以上；12000rpm，离心10分钟，弃上清；加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干；4)适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；5)鉴定后分装，-20℃保存。