一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法

摘要

一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，它是将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并获得适当分子量的胰蛋白酶-PEG聚合物，从而建立亲和双水相萃取体系，牛肺经过除杂、切块、捣碎后用硫酸酸解，然后过滤，滤液经过亲和双水相萃取后，最终的上相经过超滤脱盐和冷冻干燥后获得高纯度的抑肽酶产品。本发明制得的产品符合英国药典98版对于抑肽酶产品的要求，即大分子物质不得检出(分子筛层析)。产品的效价达到6300KIU/mg以上。

主权项

1、一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，其特征是它包括亲和双水相萃取剂的制备、亲和双水相萃取体系的建立和纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺，具体步骤工艺如下：(1)将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制备亲和双水相萃取剂：首先活化甲氧基化的聚乙二醇，即MPEG：称取MPEG 100g和无水碳酸钠20g，溶于苯500ml中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃搅拌回流24小时，离心，将上清液倾入石油醚中，温度控制在30-60℃中，得活化MPEG粗品沉淀，抽滤，将粗品用体积比为1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀，同样溶解、沉淀，反复5次，抽干，即得到活化的MPEG；然后用活化后MPEG与胰蛋白酶进行偶联：取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂缓冲液中，然后加入胰蛋白酶，搅拌，偶联条件为15℃、8小时，胰蛋白酶∶MPEG的摩尔比为1∶5，pH值7.0，采用20KD的超滤膜进行超滤去掉未偶联的MPEG；(2)亲和双水相萃取体系的建立：将胰蛋白酶-MPEG、硫酸铵溶液和抑肽胰粗提液加入到烧杯中，双水相系统的总体积为25ml，磁力搅拌，调节pH值，在500rpm的转速下离心15min，分别测定上下相的体积、双水相中的抑肽酶活性及总蛋白的含量，建立的亲和双水相萃取体系的萃取条件为：萃取温度为20-30℃、萃取体系中萃取剂的浓度为8-16％W/V、(NH4)2SO4的浓度为10-20％W/V、pH值为6.0-8.0、搅拌萃取时间为30-45min、萃取体系抑肽酶粗提液中初始蛋白浓度为5-25mg/ml；(3)纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺：取新鲜牛肺20Kg，经过硫酸酸解后，进行板框过滤，滤液调整pH值为7.0-8.0后成为抑肽酶粗提液，用于亲和萃取，每次亲和萃取体系的的体积定为1L，平均每批产品萃取50次，每批产品的处理量达到0.2亿KIU，平均萃取能力为40万KIU/次，亲和萃取后含抑肽酶的上相组分经过调整pH值至1.5-2.0后用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤后的滤出液过3KD的超滤膜进行超滤脱盐和浓缩，截留液重新用于下一批亲和萃取的萃取剂，将从上述操作中获得的浓缩液进行冷冻干燥获得高纯度抑肽酶。