冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法

摘要

本发明公开了一种冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，可以满足在不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求。并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建；本发明能够成功构建的人工角膜上皮植片，自体移植到角膜缘干细胞缺失的角膜表面，复明效果明显。在临床上具有广泛的应用潜力。

主权项

1.冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，其特征在于，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建；包括以下步骤：1)首先采用dispase冷消化角膜缘上皮组织，使之与上皮基底膜很好地分离，获取含较多角膜缘干细胞的角膜上皮细胞，在铺有明胶的六孔塑料培养板上培养扩增出角膜缘干细胞，对角膜缘干细胞的分子标记进行免疫组化检测：当CK19、P63和PCNA阳性，CK3/K12阴性时，证明所获得的细胞为角膜缘干细胞；2)将角膜缘干细胞用胰蛋白酶消化后，加入冷冻保护液后置于不同的环境温度中冻存，冷冻保护液配方：DMEM/F12+10％DMSO+10％FBS，冻存时记录角膜缘干细胞的来源，以便进行对应的角膜自体移植，冻存后的角膜缘干细胞仍具有角膜缘干细胞特性，体外可继续扩增；3)将已去上皮的人羊膜粘附到硝酸纤维素膜上，放入六孔板中，37℃干燥30min～60min后，使羊膜与六孔板底和硝酸纤维素膜粘附牢固，取冻存的角膜缘干细胞解冻后制备成浓度为1×106个细胞/ml的角膜缘上皮细胞悬液，用微量吸管仔细滴加到羊膜上皮基底膜上，加入无饲养层的角膜上皮培养液，角膜上皮培养液配方为：DMEM/F12基础培养液，添加20％FBS、20ng/mlEGF、5ug/ml insulin、0.5％ DMSO、100Iu/ml青霉素和100ug/ml链霉素，移入CO2培养箱培养，培养至8～10天，将硝酸纤维素膜从培养板底剥离，继续悬浮培养5～7天，待细胞成复层生长即停止培养，即得到准备移植的人工角膜上皮植片。