海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法

摘要

一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法。无菌水洗净海绵表面附生微生物后以人工海水浸泡、震荡释放海绵体内共生微生物制备种子液；用乙醇提取制备海绵浸出汁，添加进海水培养基中制成复合培养基；接种进行混合微生物培养。提取混合培养的微生物总DNA，采用细菌通用引物PCR扩增得到小于500bp的16S rDNA片段，进行变性梯度凝胶电泳得到基因指纹图谱；通过不同培养时间混合微生物样品指纹图条带的回收、克隆测序、同源性与系统发育分析鉴定微生物种群中的细菌种类，实现体外混合培养海绵共生微生物种群的监测。本发明可提高海绵共生微生物体外分离与培养的效率，也为制备多菌诱导产生的活性物质提供原料和技术支撑。

主权项

1、一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)海绵共生微生物的混合培养：首先用无菌水洗净海绵表面附生的微生物，然后将海绵切成1-2mm3的细小碎块，置于无菌人工海水中振荡释放出体内共生的微生物，0.45μm膜过滤制备种子液，采用乙醇抽提、减压浓缩制备海绵浸出汁，将种子液接种到添加有海绵浸出汁的无菌海水配制的培养基中混合培养；(2)混合培养的海绵共生微生物种群的监测：采用常规酚-氯仿抽提法提取混合培养的微生物的总DNA，以总DNA为模板，聚合酶链式反应扩增小于500bp的16S rDNA片段；将得到的混合片段进行变性梯度凝胶电泳得到能反映混合培养的微生物种群结构的基因指纹图谱，割胶回收DNA条带，克隆测序，通过序列的同源性比对和系统发育树分析，鉴定所培养的细菌，监测混合培养的微生物的种群结构组成，通过不同培养时间混合微生物样品的分析实现动态监测。