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1、一种能够无光照异养生长小球藻种的筛选和无光照异养培养的方法，其特征在于：具体工艺为：a、小球藻筛选和培养用培养基：小球藻培养基(1000ml去离子水中)组成：葡萄糖10.0～80g，尿素1.0～5.0g，MgSO47H2O 0.5～2.0g，KH2PO4 0.1～1.0g，K2HPO42.0～10.0g，NaCl 0.1～5.0g，CaCl2 10.0～50.0mg，FeSO4 1.0～10.0mg，ZnCl21.0～10.0mg，MnCl24H2O 1.0～10.0mg，CuCl2 0.1～1.0mg；此配制的培养基初始pH为7.0～8.0，将配制好的液体培养基放入三角瓶，将瓶口用脱脂棉封闭后在120～130℃高温、0.10～0.18MPa高压下进行灭菌10～30分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌10～30分钟，待温度降低到20～35℃后使用；b、异养小球藻种的筛选：在液体培养基中加入1.0～2.0％(重量/体积)的琼脂，经过120～130℃高温、0.10～0.18MPa高压下进行灭菌后倒入到培养皿中冷却，制备出小球藻的对应固体培养基平板；取采自于天然水体含有绿藻的水样，经离心机离心后倒去上清液，用灭菌后的液体培养基悬浮沉淀于离心管底部的藻细胞，然后再经过离心机离心后倒去上清液；重复3～5次后，用液体培养基将沉于离心管底部的藻细胞悬浮，吸取藻细胞悬浮液加入到培养皿上的固体培养基上，涂抹均匀后放在温度20～35℃无光照条件下培养；培养5～10天后，在固体培养基表面可以观察到长出的绿色单克隆藻菌落，用接种针调取单克隆藻菌落重新接种于液体培养基中，再次进行涂平板筛选绿色藻单克隆菌落；采用这种方法，经多次重复后，筛选出了一株能够异养生长的小球藻种-USTB01，其液体培养物绿色，细胞直径在3-10微米；c、小球藻的无光照异养培养：在无菌条件下，接种小球藻培养物于装在三角瓶内的灭菌后液体培养基中进行无光照异养批量培养，其条件是：振荡转速100～300转/分，温度20-35℃；连续培养3～6天后获得较高的藻生物量，藻细胞干重浓度达到20-35g/L；d、小球藻的无光照异养发酵培养：将液体培养基加入到发酵罐中，经120～130℃的高温灭菌并冷却后，接种藻培养物后进行发酵培养；培养条件是搅拌转速200～800转/分，通空气供给氧气，通过全自动流加NaOH或HCl溶液，使pH控制在6.0～9.0之间，温度通过恒温循环水保持在20～35℃；实验开始第1天以后，每天通过蠕动泵流加灭菌后的葡萄糖溶液，培养3～6天获得小球藻细胞干重浓度达到30～50g/L的小球藻培养物。 |
