组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法

摘要

本发明提供一种利用组培技术和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)生根质粒上的一段T－DNA对虎杖外植体进行遗传转化诱导培养所产生的毛状根来生产虎杖苷的方法。它包括如下步骤：A、野生虎杖组培；B、发根农杆菌的活化培养；C、虎杖毛状根的诱导培养；D、虎杖毛状根优化培养；E、虎杖毛状根中虎杖苷的提取。本发明的技术进步效果表现在：与从野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药为主的药用植物的某些有效成分，具有生产周期短、质量和产量稳定、不占用耕地等优点，而且天然药物的生产是在可控和可重复条件下进行，不会受到病虫害和自然环境等因素的影响。

主权项

1、组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，其特征在于：它包括如下步骤：A、野生虎杖组培：选取发育良好的野生虎杖植株茎段顶部的幼芽，消毒处理后经分化培养，壮苗培养，生根培养形成发育完整的幼苗，切取无菌组培苗的茎段、叶片、叶柄及幼芽等外植体作为感染材料备用；B、发根农杆菌的活化培养：取出冰箱保存的发根农杆菌菌株ATCC11325平衡20～30min，然后在超净工作台上吸取500～800μl菌液于已灭菌的100～150ml新鲜YEB培养液中，于23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振荡培养20～24h即可；C、虎杖毛状根的诱导培养：划伤受体材料表面以形成伤口，放入步骤B的农杆菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接触，取出感染材料用无菌吸水纸轻轻蘸干多余菌液，24～27℃、黑暗条件下置于MS0中进行共培养7～15天后在感染材料的伤口部位可见毛状根的萌生；D、虎杖毛状根优化培养：经分子鉴定后采用1/2MS0液体培养基，附加3％蔗糖作为碳源，在pH值为6.0～6.5，温度22～27℃，摇床转速：120～140r·min-1，在黑暗或弱光条件下6～30天获得大量增值的毛状根株；E、虎杖毛状根中虎杖苷的提取：从培养液中取出毛状根、烘干、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇结合30～40min超声波处理进行提取，之后于3000r/min离心15～20min，取上清液减压浓缩，再经过柱层析分离、浓缩、结晶、冷冻干燥，即可得到纯度较高的虎杖苷产品。