METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA CLONACION Y SUBCLONACION DIRIGIDAS UTILIZANDO RECOMBINACION HOMOLOGA.

摘要

Método para introducir una secuencia de ADN diana bicatenaria en un vector mediante recombinación homóloga, secuencia de ADN diana que está flanqueada por un primer término de ADN bicatenario por un lado, y por un segundo término de ADN bicatenario por el otro lado, secuencia diana y primer y segundo términos que residen en cualquier molécula de ADN que se replica independientemente o cualquier fuente de ADN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: a)construir un ADN vector que comprende, en el siguiente orden a lo largo de la cadena de ADN vector: (i) un primer brazo de homología bicatenario; (ii) un origen de replicación; y (iii) un segundo brazo de homología bicatenario, siendo la secuencia de una cadena del primer brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN del primer término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la secuencia de una cadena del segundo brazo de homología del ADN vector homóloga a la secuencia de una cadena de ADN delsegundo término que flanquea la secuencia de ADN diana, siendo la orientación de los dos brazos con relación al inserto deseado la misma que la orientación de las secuencias homólogas con relación al ADN diana de forma que la recombinación entre los brazos de homología y los primer y segundo términos da como resultado que se inserte la secuencia diana deseada entre los brazos de homología, b)introducir dicho ADN vector en una célula; y c)cultivar dicha célula en condiciones de forma que la secuencia de ADN diana se introduzca en el ADN vector entre los brazos de homología, en el que, bajo dichas condiciones de cultivo, dicha célula (i) comprende dicho ADN diana y (ii) expresa una recombinasa bacteriana, siendo tal recombinasa de origen fágico o bacteriano y siendo capaz de mediar la recombinación homóloga, o un equivalente funcional de la misma.