人体心肌肌钙蛋白Ⅰ的纯化和其单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了人体心肌肌钙蛋白I的纯化和其单克隆抗体的制备方法以及一步法测定其含量的方法。其特点是采用亲和层析法纯化人体心肌肌钙蛋白I，利用该纯化的心肌肌钙蛋白I与BALB/c小鼠免疫制备该心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体，并建立了一步法测定心肌肌钙蛋白I含量的方法。其优点是所得抗体的同源性好，特异性和敏感性高。其检测方法操作简单，成本低。可广泛用于心脏病的检查。

主权项

1、人体心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)取人体新鲜或速冻冷藏的心肌组织，去脂肪及纤维，经匀浆、离心、沉淀、抽提、高盐溶解等步骤处理后，在层析介质为CMSephadex-C50、Cellulose-DE52，缓冲体系为Tris-HCl，pH值为7.2～7.8，尿素含量为6～8mol/L条件下依次进行层析，分别收集含心肌肌钙蛋白C(cTnC)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)的蛋白峰；(2)取上述步骤(1)所得心肌肌钙蛋白C，在偶联溶液为0.1～0.3mol/L NaHCO3，pH值为7.8～8.5，3～6mmol/L CaCl2，平衡缓冲液为45～55mmol/L Tris-HCl，8～10mol/L尿素，0.8～1.2mmol/LCaCl2，12～18mmol/L β巯基乙醇，pH值为7.8～8.2的条件下与Sepharose 4B亲和层析柱相偶联，制备成Sepharose 4B亲和层析柱；(3)取上述步骤(1)经CM Sephadex-C50层析后的粗提品的心肌肌钙蛋白I峰收集液，再加入步骤(2)所得Sepharose 4B亲和层析柱进行亲和层析，即得纯化的心肌肌钙蛋白I；(4)取上述步骤(3)所制得的心肌肌钙蛋白I，多次注入BALB/c小鼠腹腔免疫小鼠，间隔时间为2～3周，至小鼠血清抗心肌肌钙蛋白I抗体滴度大于1∶2000，取小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞；(5)将上述步骤(4)的二种细胞混匀，加入DMEM无血清培养液处理，再加入含15～20％胎牛血清的HAT培养液，置培养箱培养，进行细胞融合；(6)取上述步骤(5)的培养液上清，用ELISA法检测培养液中的杂交瘤细胞，即心肌肌钙蛋白I的特异性抗体；(7)取上述步骤(6)检测出的杂交瘤细胞采用有限稀释法培养，制得增殖的同源性细胞克隆，即单克隆细胞株。