重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗制备中的纯化方法

摘要

本发明公开了重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程菌疫苗制备中的纯化方法。采用对基因工程菌进行高压破菌、过滤，镍离子亲和层析纯化、浓缩裂解、凝胶过滤层析及复性等技术，获得高纯度的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明本发明纯化获得的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A具有较好的免疫活性和免疫保护性。

主权项

1.一种重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗制备中的纯化方法，其特征在于：用发酵方式高密度表达rHspA后，采用高压破菌、过滤，镍离子亲和层析、浓缩裂解、凝胶过滤层析及复性技术的顺序组合，获得高纯度rHspA，步骤如下：(1)高压破菌：将高效表达可溶性重组幽门螺杆菌热休克蛋白A的大肠杆菌工程菌菌体以镍离子亲和层析平衡缓冲液混悬浮，预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀，用高压均质机破菌，高速离心，收集上清；(2)过滤：将上述上清液通过微孔滤膜过滤待用；(3)镍离子亲和层析柱纯化：选择镍离子亲和层析柱进行初步纯化，使用Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱；(4)浓缩、裂解：将步骤(3)初纯化样品浓缩后加盐酸胍或尿素，以及DTT或β-巯基乙醇变性裂解；(5)Superdex凝胶过滤层析纯化：将步骤(4)所获得的变性蛋白样本，用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡；(6)复性：将步骤(5)纯化样品采用稀释等容透析法或层析柱复性法复性，复性后的样品，采用Superdex凝胶过滤层析分离单体和聚体。