动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基

摘要

本发明公开了一种动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：(1)纤维素多孔微载体预处理；(2)细胞接种：搅拌瓶中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养；(3)细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到0％；(4)细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。本发明的优点是：(1)细胞培养密度高；(2)可方便放大培养规模；(3)细胞培养时间长，一般可达100天左右；(4)无血清培养基价格低廉；(5)反应器的生产能力高；(6)适用于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。

主权项

1、动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：(1)纤维素多孔微载体预处理：将纤维素多孔微载体用0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液浸泡4h后，倾去磷酸缓冲液，再用磷酸缓冲液洗涤3次；121℃高压灭菌30min后，吸出磷酸缓冲液，用DMEM/F12培养基洗涤2次后置4℃备用；(2)细胞接种：搅拌瓶中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min；(3)细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；(4)细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，使用无泡通气供氧系统，采用批式换液连续培养工艺，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养；所述动物细胞为贴壁细胞或悬浮细胞；所述无血清培养基包括生长型无血清培养基和表达型无血清培养基，每10L培养基的成分及其含量分别如下： 生长型无血清培养基成分及其含量DMEM/F12，1∶1 156g 葡萄糖 20g-60g碳酸氢钠 10g-20g 蛋白胨 10g谷氨酰胺 5g 6-氨基己酸 6.5g脯氨酸 110mg 亮氨酸 500mg天冬氨酸 70mg 半胱氨酸 320mg甲硫氨酸 600mg 丝氨酸 300mg甘氨酸 75mg 叶酸 100mg维生素B1 500mg 维生素B2 100mg维生素B6 500mg 维生素B12 50mg维生素C 1000mg 肌醇 2000mg烟酰胺 500mg 胰岛0素 800U转铁蛋白 25mg 乙醇胺 20mgFeSO4·7H2O 10mg ZnSO4 20mg； 表达型无血清培养基成分及其含量DMEM/F12，1∶1 156g 葡萄糖 20g-60g碳酸氢钠 10g-20g 蛋白胨 10g谷氨酰胺 5g 6-氨基己酸 6.5g脯氨酸 110mg 亮氨酸 500mg天冬氨酸 70mg 半胱氨酸 320mg甲硫氨酸 600mg 丝氨酸 300mg甘氨酸 75mg 叶酸 100mg维生素B1 1000mg 维生素B2 200mg维生素B6 1000mg 维生素B12 100mg维生素C 2000mg 肌醇 2000mg烟酰胺 500mg 胰岛素 400UFeSO4·7H2O 10mg ZnSO4 20mg。