一种烟草原生质体高效快捷培养方法

摘要

本发明提供了一种烟草原生质体高效快捷培养方法及相关培养基，该方法包括：以无菌培养30天的烟草幼苗进行原生质体游离酶解；28℃、暗酶解8小时后，以240目不锈钢筛网过滤酶解液，滤液离心后所得沉淀用CPW21溶液(CPW盐附加21％蔗糖)纯化；纯化的原生质体沉淀中加入适当体积的MS1培养基，与等体积的含1.2％琼脂糖的MS2培养基悬浮混匀，加入培养皿后在27℃恒温培养箱中暗培养；培养15天后，可长出微小愈伤组织。微小愈伤组织直接进行芽的诱导，可快速形成小植株。本法操作简便、成活率大为提高，采用本法，对开展烟草遗传改良及以烟草为模式植物进行光合作用等的研究提供高效快捷方法。

主权项

1、一种烟草原生质体高效快捷培养技术，包括下列步骤：A、原生质体游离纯化：取培养30天的烟草无菌叶片，放入酶解液中，酶解液经0.22μm混合纤维素微孔滤膜过滤除菌，其pH5.8，酶解结束，酶解液以900rpm离心7-8min，去掉上清，向所得沉淀中缓缓加入6ml的CPW21盐溶液并使沉淀悬浮，以800rpm离心6-7min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10溶液洗涤2-3次后得到的原生质体便是纯净的原生质体；B、原生质体培养：将纯化的原生质体以0.5ml MS1培养基轻轻悬浮，与等体积的MS2培养基混合均匀，加入30mm×10mm培养皿，用Parafilm膜封口后放入27℃恒温培养箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培养；其中将MS基本培养基中的大量元素减半，得到1/2MS，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L；MS2为1/2MS，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L，培养10天后，获得微小愈伤组织，直接将微小愈伤组织转入芽分化培养基，该培养基为MS，加入了噻重氮苯基脲0.5mg/L和活性炭3g/L；培养20后，获得具4片叶的小苗，再将小苗转入诱根培养基，该培养基与MS1相同，但不含任何激素，而且加入了活性炭3g/L；诱根10天左右萌发4-5条不定根，即可进行移栽。