一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子及其纯化方法

摘要

本发明以稻瘟病菌菌丝为材料，经培养冻融、匀浆离心，PM－10膜超滤，获得粗激发子。粗激发子冻融后，经系列层析纯化获得一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子，其分子量是49.08kDa，等电点为6.01，达到银染电泳纯。质谱鉴定该激发子是稻瘟病菌MG05155.4开放阅读框推测编码的hypothetical protein MG05155.4。该激发子性质稳定，诱导非亲和性互作水稻品系中苯丙氨酸解氨酶酶活的升高明显高于对亲和性互作品系的诱导，诱导水稻过氧化物酶酶海升高的最低有效浓度是1.5nmol/L。本研究在稻瘟病生物防治中具有良好的应用前景，能够为开发广谱抗病的工程菌株及无公害农药提供新依据。

主权项

1、一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子的纯化方法，其特征在于：将活化的稻瘟病菌菌丝体液体培养8-10天，双蒸水反复洗涤除去杂质，经15-25℃与-20℃反复冻融至完全破碎菌丝细胞，用双蒸水悬浮冻融的菌丝，用高速组织捣碎机12,000r/min反复匀浆5-7次，将匀浆液磁力搅拌10-12小时，4℃离心取上清液，上清液用PM-10膜超滤，所获得浓缩液即为粗激发子；粗激发子冻融1-2次后，上样HiPrep 16/10DEAE FF离子交换柱，用pH7.4的20mmol/LTis-HCl起始缓冲液平衡2倍柱床体积，流速3mL/min，未结合洗脱2倍柱床体积，用0.75mol/LNaCl梯度洗脱10倍柱床体积，收集洗脱曲线中第四峰峰尖处的洗脱液，超滤浓缩获得活性峰样；活性峰样进一步上样ConA-Sepharose 4B亲和柱，用pH7.4、含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl2、1mmol/LCaCl2、1mmol/LMnCl2的20mmol的Tris-HCl起始缓冲液平衡，在上述起始缓冲液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖进行梯度洗脱，收集洗脱曲线中第二峰峰尖处的洗脱液，超滤浓缩获得活性峰样；活性峰样进一步上样Sephacryl S-100High Resolution凝胶柱，用pH7.4的20mmo/L1Tis-HCl的起始缓冲液平衡，洗脱1.5倍柱床体积，收集洗脱曲线中的第一峰峰尖处的洗脱液，超滤浓缩，冻干后于-20℃下保存即获得新的稻瘟病菌糖蛋白激发子，命名为MGJ1。