一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法

摘要

本发明公开了一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法，首先是设计合成寡聚脱氧核糖核苷酸引物；其次是将解毒酶基因的cDNA或其氨基酸序列对应的DNA序列与家蚕丝蛋白L链启动子和终止子相连构建融合基因，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端序列之间，得到重组的转座子；第三是用转座酶基因构建转座酶基因表达载体；第四是将得到的重组转座因子和转座酶基因表达载体同时转化家蚕卵；第五是通过培养和筛选被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源解毒酶脂酶B1的转基因家蚕。本发明方法易行、操作简便、转化率高、家蚕蛹中脂酶B1含量为52％。

主权项

1、一种酯酶B1基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法，它包括以下步骤：A、设计合成寡聚脱氧核糖核苷酸引物，然后从幼蚕中取出的后部丝腺中提取总DNA，以总DNA为模板，分别用引物进行PCR扩增反应，再用限制酶消化，与酶切处理的质粒Bluescript M13连接，筛选重组子，获得PCR扩增片段，克隆的DNA片段分别为家蚕细胞质肌动蛋白基因A3启动子序列SEQ ID 1，家蚕丝心蛋白L链cDNA序列SEQ ID 2，L链基因启动子序列SEQ ID 3，L链基因3’终止子序列SEQ ID 4；B、将酯酶B1 cDNA或其氨基酸序列对应的DNA序列插入到L链cDNA序列SEQ ID 2的3’末端区域第7个外显子之中，构建成融合片段，再将此融合片断插入家蚕丝蛋白L链基因启动子序列SEQ ID 3之后及L链基因终止子序列SEQ ID 4之前，构建融合基因，将融合基因与gfp报告基因相连，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端核苷酸序列之间，得到重组转座因子，所述的反向重复末端核苷酸序列为5’-cgc cgc ggc cct aga aag ata gtc tgc gta aaattg acg cat gct gca gtg-3’，然后将重组转座因子克隆在合适的克隆载体上，构建成基因转移载体质粒；C、从piggyBac转座子中扩增转座酶基因，在其编码区上游加上A3启动子序列SEQ ID 1，并将其克隆至合适的克隆载体中，以此构建成辅助载体质粒；D、将步骤B中得到的基因转移载体质粒和步骤C中得到的辅助载体质粒同时转化家蚕卵；E、通过培养和筛选由步骤D中获得的被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源脂酶B1的转基因家蚕。