分泌人白介素－2的重组卡介苗及其构建方法

摘要

本发明涉及一种分泌人白介素－2的重组卡介苗rBCGIL－2及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片段和人IL－2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSIL－2，然后采用电转化技术将pMSIL－2导入BCG构建重组卡介苗rBCGIL－2，依靠pMSIL－2在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌IL－2。本发明得到的重组卡介苗rBCGIL－2具有BCG和IL－2的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤及结核病；利用重组卡介苗rBCGIL－2在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用IL－2的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。

主权项

1、一种分泌人白介素-2的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)卡介苗穿梭表达载体的构建：根据已有的卡介苗分泌抗原Ag85B信号肽和IL-2的基因序列，分别设计Ag85B信号肽和IL-2的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成得到Ag85B信号肽和IL-2的基因片段，将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将IL-2基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到卡介苗穿梭表达载体pMSIL-2；2)卡介苗的培养：选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD600值＝0.6，制得感受态卡介苗；3)电转化技术构建重组卡介苗rBCGIL-2：在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSIL-2，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGIL-2，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养；4)重组卡介苗rBCGIL-2的鉴定与功能检测：进行抗酸染色初步确定rBCGIL-2为抗酸杆菌，抽提rBCGIL-2质粒DNA后，PCR扩增得到IL-2的基因片段，Western blotting检测到rBCGIL-2培养上清中和菌体中有IL-2蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGIL-2培养上清中有高含量的IL-2。