主权项 |
1、一种油菜未成熟小孢子胚直接萌发成植株的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:A、小孢子的制备:选取小孢子处于单核晚期的新鲜花蕾,消毒,无菌水洗去消毒液,在B5培养基中轻轻挤压花蕾,使小孢子游离至培养基中,过筛除花蕾组织残渣,离心收集小孢子;B、小孢子胚的诱导:用NLN-13培养基调小孢子密度至1-2×105/mL,分装小孢子于培养皿中,32℃恒温暗培养14天,移至25℃,2-10μmol·s-1·m-2,培养8-11天,再用NLN-0培养基稀释至300-400胚状体/3.5cm培养皿,弱光培养10-16天,形成未成熟小孢子胚;C、小孢子胚的选择:用于萌发的小孢子胚是刚生根,或还未生根,下胚轴较短,长度小于5mm未分化完全的胚;D、小孢子胚的萌发:将未分化完全的胚的根插入含附加氯化钙和硝酸铵的MS固体培养基中,在28-35℃恒温,在光照为2-10μmol·s-1·m-2时,培养12-16天形成植株,其中未成熟小孢子胚的培养基的组成是: MS常用培养基 500毫升 水 500毫升 氯化钙 300-600毫克 硝酸铵 80-120毫克 硫胺(维生素B1) 2-6毫克 维生素H 0.04-0.06毫克 叶酸 0.4-0.6毫克 维生素B6 0.8-1.2毫克 烟碱酸 4-6毫克 氨基乙酸 1-3毫克 谷氨酰胺 6-10毫克 天冬酰胺 3-5毫克 蔗糖 20-30毫克 琼脂 6-10毫克 调PH至5.3-6.0。 |