主权项 |
1.检测人21号染色体数目的方法,其特征是:通过应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记,在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记,在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记,分别设计两对引物及相应的Taqman探针,采用多重实时定量PCR技术对目标分子标记和内参分子标记进行同管扩增,通过delta ct值来确定21号染色体数目并由此诊断21三体综合征,通过以下步骤实现:(1)选择染色体的分子标记21号染色体上的目标分子标记为GTTGATGGGC TTGCGCTTAT CTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中上游引物序列:5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’ 下游引物序列:5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’ Taqman探针序列:5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参分子标记为TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列:5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’ 下游引物序列:5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’ Taqman探针序列:5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)标本制备取新鲜EDTA抗凝全血或羊水,采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取DNA,用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度;(3)多重实时定量PCR扩增采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标分子标记及内参分子标记,反应体系25μl,含基因组500-25000拷贝,加入两对引物各500nM,相应Taqman探针200nM,dNTP100μM,Mg+3.5mM,Taq酶5U,ROX200nM,反应条件为95℃5分钟预变性;95℃30秒,60℃30秒,两步法40个循环;(4)定量分析采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析,分析体系设置为0.14,基线范围起点为第6个循环,终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环,软件自动输出各扩增片段的ct值,计算delta ct值,根据不同的delta ct范围来判断21号染色体数目。 |