BT－CRY毒素的迅速检测

摘要

本发明基于使用1)抗两种Cry毒素的2个多克隆IgG，2)从鳞翅目幼虫分离的Cry毒素受体以及3)制造免疫层析带的手工剥离方法，该层析带用于检测多种分析物。免疫层析带促进迅速检测分析物，如果用单克隆抗体产生带则费用贵且印度农民和推广人员不能承受。本发明的主要目的是简化检测Cry(Bt)毒素的免疫层析检测方法，使用特异于分析物的亲和纯化多克隆抗体，也提供一种在印度社会中适用于制造“Cry1Ac/Cry1Ab/Cry2Aa/Cry2Ab毒素”检测带的费用可接受且有力而简便的方法。抗Bt(抗Cry1Ac或抗Cry2Aa/Ab或两者)抗体或Cry受体蛋白通过手工剥离固定于硝酸纤维素膜。用酪蛋白或BSA和防腐剂封闭膜。抗Bt(抗Cry1Ac或抗Cry2Aa/Ab或两者)抗体用金标记并吸收在玻璃纤维膜上，此膜置于硝酸纤维素膜底部以重叠2mm。由于使用两种不同动物(山羊和兔)中培养的抗原亲和和蛋白A亲和纯化多克隆IgG，测定的特异性和精确性大为提高。Cry毒素检测侧向流动带的原理图示于所附图。因而产生的带代表迅速、敏感的装置和方法，用于检测Cry1Ac/Cry1Ab/Cry2Aa/Cry2Ab和结晶毒素的存在，它们来自转基因植物或在Bt－发酵产物中。方法和装置有高敏感性用于同时检测单一带上的一种或两种Cry毒素。使用本发明提供测定系统，系统含最少数量的步骤，即使由未经训练的人使用也产生可靠结果。

主权项

1.一种用多克隆抗体制备快速免疫层析测定/带的方法，所述抗体鉴定/检测来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素作为来自种子或植物组织的单一毒素，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)鉴定独特的天然苏云金芽孢杆菌菌株，通过抗生素抗性分布、菌落形态和生长特征来确定所述菌株特征，用特异引物从所述菌株的质粒扩增生成晶体蛋白的基因并克隆到特定表达载体中；(ii)使用包括层析和电泳在内的多种方法纯化Cry1Ac和Cry2Aa至明显均匀；(iii)通过给兔和山羊周期性注射强化剂量的与佐剂混合的结晶毒素并收集其血清、沉淀所述血清并纯化抗体在兔和山羊中培养步骤(ii)所述毒素的多克隆抗体；(iv)使用亲和层析法从步骤(iii)所述抗血清中纯化IgG，包括蛋白A和Cry1Ac/Cry2Aa抗原；(v)使用步骤(iv)所述抗Cry多克隆IgG以固定于膜上；(vi)在硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜(5到12微米)上固定捕获线，所述线含步骤(iv)所述在山羊中培养的所述多克隆IgG，采用手工剥离方法，用手持式紫貂毛刷；(vii)在硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜(5到12微米)上固定捕获线，线含步骤(iv)所述在兔中培养的所述多克隆IgG，使用手工剥离方法，用手持式紫貂毛刷；(viii)用胶态金20-40nm标记步骤(iv)所述在山羊中培养的多克隆IgG抗体；(ix)用胶态金20-40nm标记步骤(iv)所述在兔中培养的多克隆IgG抗体；(x)用微量移液管在玻璃纤维垫上固定步骤(viii)的金-抗体缀合物；(xi)用微量移液管在玻璃纤维垫上固定步骤(ix)的金-抗体缀合物；(xii)手工剥离山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG，其为各带中离膜顶端0.5cm的30cm×0.1cm的线；(xiii)所述步骤(xii)的山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG线会分别捕获金标记的抗兔抗体或抗山羊抗体，在任何集合带中也如此；(xiv)权利要求1步骤(xii)所述的线可作为对照线以指示所述带的适当功能；(xv)使用时，权利要求1步骤(xii)的所述线会变成粉色/紫色，无论测试样品是阳性或阴性；(xvi)膜用含有蛋白、糖和防腐剂的封闭缓冲液封闭，并用磷酸缓冲盐水洗涤两次并干燥30分钟，然后集合；(xvii)在权利要求1步骤(vi)所述的膜上集合权利要求1步骤(x)所述金-缀合物浸渗的玻璃纤维，以如图1所示重叠2mm；(xviii)在权利要求1步骤(vii)所述的膜上集合权利要求1步骤(x)所述金-缀合物浸渗的玻璃纤维，以如图1所示重叠2mm；(xix)在权利要求1步骤(vi)所述的膜上集合权利要求2步骤(xi)所述金-缀合物浸渗的玻璃纤维，以如图1所示重叠2mm；(xx)在权利要求1步骤(vii)所述的膜上集合权利要求2步骤(xi)所述金-缀合物浸渗的玻璃纤维，以如图1所示重叠2mm；(xxi)完成聚集，这是通过将样品释放滤纸垫(1-2mm厚)置于步骤(xvii、xviii、xix和xx)所述集合底端以重叠2mm，第2个样品吸收垫置于权利要求1步骤(vi)和(vii)所述膜顶端以重叠2mm；(xxii)冷层叠终集合；(xxiii)使用在一种动物(山羊)中培养的一种抗Cry抗体捕获线与抗原三明治的组合来检测毒素作为可见线，所述抗原在步骤(xix)所述在另一种动物(兔)中培养的金标记的抗Cry抗体之间；(xxiv)在一种动物(兔)中培养的一种抗Cry抗体捕获线与抗原三明治的组合来检测毒素作为可见线，所述抗原在步骤(xviii)所述在另一种动物(山羊)中培养的金标记的抗Cry抗体之间；(xxv)在一种动物(兔)中培养的一种抗Cry抗体捕获线与抗原三明治的组合物来检测毒素作为可见线，所述抗原在步骤(xx)所述在相同动物(兔)中培养的金标记的抗Cry抗体之间；(xxvi)在一种动物(山羊)中培养的一种抗Cry抗体捕获线与抗原三明治的组合物来检测毒素作为可见线，所述抗原在步骤(xx)所述在相同动物(山羊)中培养的金标记的抗Cry抗体之间；(xxvii)步骤(xxii)到步骤(xxvi)用于检测cry毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa和Cry2Ab。