用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法

摘要

利用山羊奶蛋白β－酪蛋白的调控序列调控改构的人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因(t－PAm)在转基因山羊的乳腺表达。构建随机整合载体(pGBCN－tPAm和pGBC2－tPAm)和β－酪蛋白基因打靶载体(pGBC4－tPAm)。在构建中利用了来自关中奶山羊的β－酪蛋白调控序列和3’端序列，考虑到用于细胞转染，在载体的3’端也连接了neo^r基因。在本发明中包括使用这三种载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞，利用体细胞核移植技术对随机整合和同源重组的阳性细胞进行克隆以得到新的山羊个体，此山羊所携带的人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因能在β－酪蛋白基因调控序列的指导下表达，从而在山羊的乳腺里分泌人组织型纤溶酶原激活剂突变体。

主权项

1、利用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法，包括以下步骤：(1)奶山羊的β-酪蛋白基因5’端和3’端序列克隆与鉴定；(2)随机整合山羊细胞的乳腺表达载体的构建；(3)基因打靶载体的构建；(4)分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞；(5)转染奶山羊胎儿成纤维细胞；(6)随机整合与同源重组的细胞鉴定；(7)核移植和胚胎的激活与体外培养；(8)转基因山羊及乳腺表达产物的鉴定。