温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法

摘要

本发明公开了一种温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。步骤如下：1)配制聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶反应物的水溶液；2)反相悬浮法制备温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶；3)温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性。本发明所开发的温敏型聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶，作为一种新型的蛋白质体外复性的添加剂，可使溶菌酶的活力回收率比稀释复性提高68％以上，凝胶重复利用8次后溶菌酶的活力回收率仍比稀释复性提高22％以上。该凝胶具有高效、影响复性的参数较少、操作方便、仪器设备要求较低且易于分离回收等优点，可降低生产成本，因而在蛋白质体外复性领域具有较好的应用前景。

主权项

1.一种温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法。其特征在于方法的步骤如下：1)配制聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶反应物的水溶液将单体N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及氧化剂过硫酸铵，其中单体与交联剂浓度为5-15％(w/w)、交联度为1-10％(w/w)、过硫酸铵浓度为0.1-0.7％(w/v)，溶于25mL去离子水中，用微滤膜过滤溶液以除去未溶解的杂质；2)反相悬浮法制备温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶先向反应容器中加入75mL液体石蜡作为分散相，37.5-150 mg Tween80作为表面活性剂，充分分散后加入步骤1)反应物的水溶液，搅拌后加入1μL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺作为加速剂引发聚合，聚合温度20-25℃，机械搅拌速度为350-450rpm，聚合3-4h，整个过程均需向反应容器中通入N2，得到粒状聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶，用1-5体积比率的无水乙醇/水溶液洗涤该凝胶，将凝胶于真空干燥箱中50-70℃烘干24-36h；3)温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性称取5-20mg/mL溶菌酶试剂溶于变性缓冲液中，置于摇床中反应，即可获得无活性的伸展态的溶菌酶溶液，取0.05-0.25mL该溶液，缓慢加入复性缓冲液，稀释到终体积均为5mL，再向溶液中加入20-120mg/mL的粒状PNIPA凝胶，充分震荡使其分散均匀后，于4-36℃、0-180rpm摇床中复性2-5小时。