主权项 |
1.一种牛肾上腺髓质嗜铬细胞分离纯化的方法,其主要步骤是:分离:a)选择牛肾上腺,保存于0-6℃的D-Hank’s液中;b)逆静脉灌注无钙、镁D-Hank’s液后,将肾上腺浸泡在D-Hank’s液中,使残留在血管中的血细胞充分渗出;c)逆肾上腺静脉灌注质量百分比浓度为0.05-0.15%的I型胶原酶2-7ml,在37℃恒温震荡水浴中消化20-50min,使皮质和髓质及髓质细胞之间的胶原成分充分解离;d)剥除皮质,将髓质剪碎成0.5-1.5mm3左右的小块,滴加D-Hank’s液以保持髓质的营养;e)将剪切后的髓质块依次研磨过50、200、350目筛网,并用D-Hank’s液冲洗过滤;收集的细胞用D-Hank’s液离心洗涤,最终接种于含有体积比5-20%牛血清的DMEM培养液中;纯化:f)分别配制密度为1.090g/ml、1.064g/ml、1.034g/ml和1.019g/ml的Percoll溶液;g)将分离步骤中e制得的细胞悬液沉淀,与密度为1.090g/ml的Percoll溶液混悬后,加入离心管底,在其上依次加入密度为1.064g/ml、1.034g/ml、1.019g/ml的Percoll溶液离心;h)收集介于密度为1.064g/ml与1.034g/ml的Percoll溶液之间的细胞,加入D-Hank’s液离心洗涤;最终将细胞接种于含有体积比5-20%牛血清的DMEM培养液中培养。 |