双侧植入两种细胞的复合人工皮肤及其构建方法

摘要

本发明涉及一种双侧植入两种细胞的复合人工皮肤及其构建方法，它以含有表皮生长因子的牛胶原膜为支架，双侧植入成纤维细胞和表皮细胞，中部为生长的成纤维细胞，其密度均＞10⁶个/cm²，该人工皮肤具有良好的物理特性、强度大、柔韧性好、抗感染能力强、无抗原性、移植手术方便、移植后与周围皮肤融合性好的优点有效果。

主权项

1.一种双侧植入两种细胞的复合人工皮肤的构建方法，其特征在于它按下述步骤进行：1).含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建：a)、将胎牛皮或牛跟腱按常规方法进行脱毛、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用蒸馏水洗涤后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，温度0～20℃，振动24～32小时，再加入氯化钠至上述溶液中，氯化钠浓度达到2M，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；b)、再将(a)项的胶原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀的胶原海绵膜，将胶原海绵膜置于0.5～10％浓度的丙三醇溶液中，吸附膨胀后取出，在105～130℃温度下真空干燥18～32小时；c)、将肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素与醋酸溶液用量比为W/V0.1～100mg/ml，用100目滤网过滤，得到肝素醋酸溶液；d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子与三蒸水的用量比为W/V0.1～100mg/ml，得到表皮生长因子水溶液；e)、最后将(c)项的肝素醋酸溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50∶1混合，振动混合48小时后取混合液与5％的丙三醇溶液以体积比0.1～5％混合，用混合液浸润(b)项的胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃冷冻4～10小时，再真空干燥，得含有表皮生长因子的胶原海绵膜，2).双侧植入两种细胞复合人工皮肤的构建：将1)项含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，经Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代培养的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下液面培养二周后，用含有表皮细胞生长因子10μg/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养1天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养10天，用不锈钢筛网作支持，并以气液界面培养14天，即构建成双侧植入成纤维和表皮细胞的复合人工皮肤。