西瓜离体诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术

摘要

本发明公开了一种西瓜离体诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术，它利用二硝基甲苯类除草剂(DNH)代替常用的秋水仙素作为诱导剂，作用是通过干扰纺锤体的机制而抑制细胞分裂中期的有丝分裂，使组织细胞染色体加倍，应用组织培养进行多倍体诱导与常规植株诱变方法相比，具有明显的优越性。(1)可以反复大批量地处理植物愈伤组织、丛生芽等，提高诱导成功率；(2)组织培养条件不受季节等自然条件的影响，可在室内进行，诱导条件易于控制，可以大大缩短诱导所需要的时间；(3)组织培养诱变后的植株，用试管苗进行早期倍性鉴定，比田间更直接。(4)利用乙酸盐荧光黄(FDA)染料涂抹在西瓜离体幼叶的下表皮上，在荧光显微镜下观察保卫细胞叶绿体的数目，根据荧光叶绿体的数目进行倍性早期鉴定，二硝基苯胺类诱导剂比秋水仙素毒性小，诱导频率高，且成本较低。

主权项

1、一种西瓜离体诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术，包括以下步骤：(1)茎尖培养：将二倍体种子去掉种皮，用千分之一升汞消毒10分钟，无菌水清洗3～5遍，黑暗下浸种8小时，在1/2 MS培养基上发芽，培养8天；(2)诱导处理：先将用20-200μmol/L浓度的二硝基苯胺类除草剂-氟乐灵(Trifluralin)或双丁乐灵(Butralin)或二甲戊乐灵(Pendimethalin)进行过滤灭菌处理，然后将药液加到液体培养基中(MS+BA 2.0mg/L)中；将二倍体西瓜茎尖切下，放在液体培养基(激素及浓度为BA2.25mg/L)中，在25℃的空气震荡浴中处理一定时间；(3)分化与继代培养：将药液中的茎尖取出，放在灭菌水中清洗，用滤纸吸干，放在MS+BA 2.25mg/L固体培养基上培养30天，转至MS+BA 1.5mg/L继代培养基中继代2次；(4)生根培养：将伸长的幼苗转至MS+IAA 0.5mg/L生根培养基中，生根后取平展的叶片和根尖备用；(5)西瓜倍性早期鉴定：把组织叶片放在载玻片上，将0.1％荧光黄(FDA)滴于叶片背面，盖上盖玻片，在荧光显微镜下很清楚看出气孔内的叶绿体呈荧光，一对保卫细胞内叶绿体数目多于15个初步判断为四倍体；(6)根据试验结果，处理浓度10μmol/L，处理时间6天诱变频率较高(50-60％)。但不同品种对不同诱导剂反应不同。而秋水仙素处理(CK)在100μmol/L，处理时间9天最高，只有15-23％的诱导频率；(7)扩繁：对初步鉴定的四倍体转至MS+BA 1.5mg/L继代培养基中扩繁，然后生根移栽。