长春花完全适应型细胞大规模培养生成吲哚类生物碱的方法

摘要

本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种激素完全适应型长春花细胞培养生成吲哚类生物碱的新方法。本发明以野生长春花种子为原始材料，获得长春花无菌苗，进一步诱导出愈伤组织，经过多代定向诱导驯化，建立了适合大规模培养的激素完全适应型细胞培养系统，该培养物中总生物碱含量和野生长春花相当，但培养物中不含具有细胞毒的长春碱和长春新碱。

主权项

1.一种应用长春花细胞大规模培养生成吲哚类生物碱的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)按配方配制生长和生产培养基： 生长培养基mg/L 生产培养基mg/L(NH4)2SO4 134 30KNO3 2000 400CaCl22H2O. 150 210MgSO47H2O 250 290NaH2PO4H2O 150 30KI 0.75H3BO3 3.0MnSO4·4H2O 10ZnSO4·7H2O 2.0Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8 27.8Na2·EDTA·2H2O 37.3 37.3肌醇 100 100烟酸 1.0 0.5盐酸吡哆醇 1.0 0.5盐酸硫胺素 10 3蔗糖 2％-3％w/v 白砂糖3％w/vpH 5.6-5.8(2)完全适应型长春花细胞系制备1)以长春花种子为材料，经灭菌并培养得到无菌苗；2)以所获无菌苗的茎、叶等器官为外植体，在B5固体基本培养基加上2，4-D 2mg/L和KT O.2mg/L培养，温度25+1℃，经4周暗培养，在外植体的切口部位形成愈伤组织；3)将所得到的愈伤组织用上述2)相同的培养基培养10代，平均三周继代一次，培养温度25+1℃，无光照；4)将所得的愈伤组织继续继代培养，在上述2)所述培养基中逐渐减少2，4-D用量，培养8-10代后，将2，4-D减少到零，固体B5培养基上的培养周期为4周，或液体B5培养基上的培养周期为12-15天，形成稳定的完全适应型长春花细胞系；(3)按生长培养基配方制备生长培养基，调节至pH5.4-5.6，分装于250ml三角瓶中，封口并高温灭菌，以步骤(2)方法制得的细胞为种源，接种于上述生长培养基中培养扩增，培养条件为温度25±1℃，暗培养，摇床转速110-120转/分钟，10天继代一次，作为种子细胞；(4)按生产培养基配方制备生产培养基，调节至pH5.4-5.6，分装于1000ml三角瓶中，每瓶300-400ml，按15％W/V接入种子细胞进行培养，温度25±1℃，摇床转速为120转/分钟，黑暗，培养10-12天后，提取生物碱。