海带全基因组DNA提取方法

摘要

本发明提供了一种海带全基因组DNA提取方法。在传统的海藻基因组DNA提取方法中，多采用CsCl超速离心、柱层析纯化等物理或化学方法以减少多糖污染，既不经济又繁琐、耗时。本方法的特征在于将海带孢子体实验材料清洗、经适量的褐藻酸裂解酶处理，降解大部分多糖，再沉淀分离得到单细胞，用阳离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理，苯酚和异戊醇混合液抽提，除去剩余的多糖，异丙醇沉淀、临界干燥，最后用冷乙醇洗涤、沉淀，真空干燥，可成功地提取高质量的海带全基因组DNA。通过生物酶法对样品预处理后提取的DNA可应用于海带种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等方面的研究。该方法具有简单、经济、易于操作等优点，适合在普通生物实验室中操作和推广。

主权项

1.一种海带全基因组DNA提取方法，其特征在于以下操作：1)用无菌海水清洗实验材料，按每克实验材料需用8mL的比例加入酶解液，该酶解液内含0.8M甘露醇、50mM柠檬酸三钠、1％纤维素酶、0.5％离析酶R-10和0.2U/mL褐藻酸裂解酶，然后放置于摇床上，在14℃、黑暗条件下酶解处理6-8h，其中实验材料为新鲜的、冷冻的或干制的海带孢子体，当是冷冻或干制的孢子体标本，事先必须用海水浸泡处理；2)将1)所得解离单细胞经240目筛绢过滤，并以3000×g离心收集后，按每mg鲜重细胞6mL的比例加入CTAB提取缓冲液，该缓冲液内含重量体积比为3％的CTAB、1.4MNaCl、20mM EDTA、10mM且pH为7.8的Tris-HCl和重量体积比为2％的巯基乙醇，然后于65℃水浴45-60min；3)向2)体系中加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，该混合液两种成分的体积比为24∶1，离心后取上清液，加2/3体积冷异丙醇沉淀，再离心，所得沉淀用70％乙醇洗涤，溶解于TE溶液，该溶液内含10mM且pH为8.0的Tris-HCl和1mM的EDTA，离心取上清液；4)在3)所得上清液中加入1/3体积7.5M NH4Ac和2.5倍体积95％的乙醇，低温放置，离心，用70％冷乙醇清洗，真空干燥，于4℃保存备用。