鳗弧菌的PCR检测方法

摘要

本发明属于水产动物疾病的诊断技术，具体地说是一种对养殖动物鳗弧菌的PCR检测方法。包括由样品处理试剂A和B、PCR试剂管、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚蓝上样缓冲溶液组成的PCR检测试剂的配制以及一次PCR、一次PCR扩增产物分析等一套检测操作程序，增加了二次PCR处理程序。本发明能在一次PCR反应的基础上，建立二次PCR反应方法，可快速、准确、敏感地检测出样品中的鳗弧菌，为水产养殖动物的疾病诊断提供简单快速准确的方法，也可应用于对养殖水体和饲料的质量监测。

主权项

1.一种所述检测鳗弧菌的PCR方法，其特征在于包括下列步骤：1)样品处理：取0.5～1克或0.1～0.5ml样品，用200～400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000～12000g离心2～5分钟；2)DNA提取：弃上清，用100～200μl试剂A再次悬浮沉淀，再加入20～100μl试剂B混匀；或取上清，再加入20～100μl试剂B混匀，室温放置2～10分钟，再在55～65℃浴中保温10～15分钟，10000～12000g离心8～10分钟，取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5～10分钟，10000-12000g离心5～10分钟；去上清，70～75％乙醇洗涤1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于10～50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，2～8℃保存备用；3)一次PCR：在PCR试剂管中加入0.5～1μl所述的DNA提取液，每管加入2.5单位/ml的Taq酶0.5～1.0μl，3000～5000g离心2～5秒钟混匀，置于PCR仪内进行扩增；通过94～96℃解链2～5分钟；然后94～96℃变性40秒～1分钟，55～60℃复性30秒～1分钟，72℃延伸40s～1分钟，如此进行循环25～35次，最后72℃延伸6～10分钟，得扩增样品；4)一次PCR扩增产物分析：取5～10μl扩增后的样品，与2～6μl 0.25％(w/v)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙锭的0.8～1％(w/v)琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔有一条593bp核酸条为有鳗弧菌感染或污染的阳性样品。