一种分离猪肝干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种分离猪肝干细胞的方法，该方法结合了大部分肝切除、酶消化与密度梯度离心法，分离出猪肝干细胞，其步骤包括：大部分肝切除促进肝再生、胶原酶将肝组织消化为单个细胞、离心去除肝内的成纤维细胞、蛋白酶E特异性消化肝实质细胞，而保留肝非实质细胞、Percoll密度梯度离心进一步纯化。本发明提供的方法能获得纯度高、数量多且活性好的猪肝干细胞，为猪肝干细胞的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。

主权项

1、一种分离猪肝干细胞的方法，其包括如下步骤：1)按常规方法进行猪肝大部分切除术；2)术后饲养5～10天，每天向步骤1)处理的试验猪的腹腔注射30～80ml含100 IU抗生素的10wt％葡萄糖溶液；3)取出试验猪的肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管，使用冷Hank’s平衡盐溶液洗涤，剪碎肝组织块；4)加入50ml含0.02～0.03wt％EDTA的0.020～0.040wt％胶原酶，在37℃下于恒温振荡器上消化15～20分钟，加等体积Hank’s平衡盐溶液终止消化；5)过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，以500～1000rpm转速离心3～5min，分出的上清液再以1500rpm转速再离心5～10min；6)向步骤5)得到的沉淀物加入50ml的DMEM培养基，在37℃于恒温振动器上消化15～20分钟，消化1～3次，然后以1500rpm转速离心8～12min；7)向步骤6)得到的沉淀物，按3ml/108细胞的量加入含NH4Cl的Tris缓冲溶液，处理1～5min，再加入50ml冷Hank’s溶液洗涤后，以1500rpm转速离心5～10min；8)倾出上层清液，沉淀物加入10ml Gey’s平衡盐溶液，制成细胞悬液；9)向离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml 17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml步骤8)制得的细胞悬液，室温下以1500rpm转速离心15～20min，收集17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。