甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法

摘要

甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，包括甘蔗、斑茅基因组DNA提取、试剂配制、扩增和电泳检测。该鉴定方法能从DNA分子水平上获得最直接的杂种证据，具有准确、直观、便捷的特点，鉴定速度快，环境影响因素小，鉴定的准确率高，成功地解决了长期以来甘蔗斑茅杂种鉴定的困难，确保了被鉴定杂种的真实性，提高了育种利用的有效性。

主权项

1、甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，其特征在于鉴定方法如下：(1)基因组DNA提取：供鉴定的甘蔗斑茅杂种叶片经液氮研磨，依次加入CTAB提取缓冲液、聚乙烯基吡咯烷酮、月桂酰肌氨酸钠、CTAB溶液；经水浴加温、室温冷却，再用酚、氯仿抽提纯化、异丙醇沉淀、然后TE溶解；(2)试剂配制：反应体系含1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1～0.3mmol/L；Taq DNA聚合酶0.1～5国际单位；分离纯化的DNA模板液0.1～5μl，；PCR引物1对，各0.1～2μmol/L；加无菌去离子水使总体积达到10～100μl；上述PCR引物在以下引物中选取：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGTITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGCITS3：TTGGCCGCCGTCCCATCCTCITS4：AGAAAAAGAAAAACAAAGGCITS5：TTCAGGTTTTTGGAGAACGGITS6：ACAAATTGGACTCTTGGAGCITS7：GGAAGAAAGAAAACAAGGGTITS8：GGGACGGMCMAAACAAAATTITS9：ACCCTTGTTTTCTTTCTTCCITS10：AATTTTGTTTGGGCCGTCCC(3)扩增程序：90-98℃预变性1-10min，90-98℃变性10-120s，45-65℃退火10-120s，65-80℃延伸10-120s，共20-40个循环，最后65-80℃保温1-10min；(4)电泳检测：扩增结束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus为marker，用含有EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；