光肩星天牛的PCR鉴定方法

摘要

本发明涉及一种林木蛀干害虫光肩星天牛的PCR鉴定方法，测定光肩星天牛的线粒体DNA CO I基因序列，包含保守与变异序列，利用DNA SIS软件对这些DNA序列进行比较，根据光肩星天牛特有的一段保守序列设计特异引物：上游引物5′TATAAGATTTTGATTACTCCCG 3 ′下游引物5′CGATCTGTTAAAAGTATAGTA 3′提取虫样的DNA进行PCR扩增，取扩增产物采用1.3～1.5％的琼脂糖凝胶，在70～100V下电泳20～40分钟，紫外灯下检测，如存在分子量为341 bp DNA条带，则确定所检昆虫为光肩星天牛。本方法对在口岸木材及货物木质包装检疫中截获的光肩星天牛进行快速、有效地鉴定。

主权项

1.光肩星天牛的PCR鉴定方法，其特征是首先测定不同地理种源光肩星天牛及其近缘种的线粒体DNA CO I基因序列，然后利用DNA SIS软件对这些DNA序列进行比较，再根据光肩星天牛特有的一段保守序列设计特异引物如下：上游引物 5′TATAAGATTTTGATTACTCCCG 3′下游引物 5′CGATCTGTTAAAAGTATAGTA 3′然后按下步骤操作：①虫样DNA的提取：虫体用0.9％的生理盐水洗净，剪碎；取0.1-0.2g样品到玻璃匀浆器中，加入1mL SDS消化液，包括：20mmol/L Tris-Cl，pH7.4；20mmol/L EDTA，pH8.0；0.5％SDS，充分匀浆，加30μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀，50～55℃的水浴消化过夜；消化后样品经12000r/m离心5～10分钟，取上清；加入酚和氯仿异戊醇各0.5mL，充分摇匀，12000r/m离心10分钟，取上清，并重复此步骤一次；加入1mL的氯仿异戊醇，摇匀，12000r/m离心10分钟，取上清；加入相当于上清液2倍体积的无水乙醇及0.1倍体积的醋酸钠，摇匀，-20℃下至少静置2小时，使DNA沉淀；12000r/m离心10分钟，取沉淀物，用300μL 70％乙醇进行漂洗，12000r/m再离心10分钟，倒掉乙醇，风干；将风干沉淀物溶于50μL的双蒸水或1×TE中，置于50～60℃水浴3～5分钟；后于-20℃中存贮，用于PCR扩增；②PCR检测：每次PCR检测的反应体系总体积为50μL，包括：31μL双蒸水；2.5μL二甲亚砜；5μL 10×Buffer；4μL MgCl2；4μL dNTP；上、下游引物各1μL；1μL DNA及0.5μL Taq酶；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；后进行35个循环：94℃变性30秒，57℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒；最后72℃再延伸7分钟；取8μL扩增产物，采用1.3～1.5％的琼脂糖凝胶，在电压70～100V下电泳20～40分钟后在紫外灯下检测，如果存在分子量341bp的DNA条带，则确定所检昆虫为光肩星天牛。