高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法

摘要

本发明是利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法。设计了一对高特异性鉴别引物，通过高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别中药材乌梢蛇与市场上常见的伪品：滑鼠蛇、黑眉锦蛇、红点锦蛇、王锦蛇、赤链华游蛇、玉斑锦蛇、赤链蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、三索锦蛇。使用此方法鉴别乌梢蛇的真伪，只通过简单的乌梢蛇及其伪品的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对药材真伪的鉴别。操作简单、易于掌握、准确性高。

主权项

1.一种高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别真伪乌梢蛇的方法，其特征在于：DNA模板提取、PCR扩增、电泳检测三个步骤。模板DNA的提取：选取无霉变和虫蛀的药材标本肌肉部分1g，置于研钵中经液氮速冻后研成粉末，将粉末速转移至50ml离心管中，加入6ml已灭菌的匀浆缓冲液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA 1mmol/L PH＝8.0)进行混匀，加入蛋白酶K至终浓度为150μg/ml，再加入10％SDS至终浓度为0.8％。55℃水浴中3-4h，其间轻摇数次，取出冰浴至4℃，400g离心5min，取上清液，加入等体积Tris饱和酚抽提，混匀10min，两相成乳状，5000g离心15min，取上层水相，重复一次，再用CHCl3抽提两次。CHCl3抽提离心后取上层水相加入两倍无水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中过夜。第二天取出，5500g离心15min，沉淀物用70％EtOH洗涤两次，室温挥干EtOH，用适量TE溶解DNA，-20℃备用PCR扩增：PCR反应体系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/l KCl，0.1％TritonX-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，两种高度特异性鉴别引物HWL-1即5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’和HWH-1即5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’，各10pmol/l，DNA模板约100ng，反应在(PTC-100)基因扩增仪上进行扩增；循环参数：95℃预变性4min；95℃变性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10个循环；95℃变性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15个循环；72℃延伸5min。电泳检测：PCR实验中设置无模板DNA的阴性对照，反应完成后，取5μl反应液经EB染色，1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在310bp-320bp范围内处扩增出明亮唯一条带的样品即为正品乌梢蛇，混淆品均应无任何条带出现。