褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法

摘要

本发明褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子生物学检测方法属于抗药性综合治理和褐飞虱综合防治范畴。所使用的特异性引物P：5′－ACA CGT CCC CAG TGA GCA－3′，Q：5′－GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC－3′，A：5′－ggggggggcc GTT TGG ATC CTG TAC ATC－3′，B：5′－ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT－3′。25μL反应体系：2.5μL 10×Buffer，1.25 U Ex－Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl₂ 1mmol/L，引物各1μmol/L，加双蒸水至反应总体积为25μL。PCR扩增产物可以直接凝胶电泳检测。该方法稳定性高、周期短、灵敏度高。

主权项

1、褐飞虱对吡虫啉靶标抗性的分子检测方法，包括：1)特异性引物：外引物P：5′-ACA CGT CCC CAG TGA GCA-3′ Q：5′-GTC GGT GGA ATG ATC TCT GC-3′ 内引物A：5′-ggggggggcc GTT TGG ATC CTG TAC ATC-3′ B：5′-ggggggggcg CAT GAT TGC CGT CGT-3′2)单头褐飞虱基因组DNA的提取：(1)配制提取液A：1％(g/mL)SDS，50mmol/L Tris HCl，25mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，溶剂为超纯水；提取液B：3mol/L KAC，PH7.2，溶剂为超纯水；(2)将试虫置于1.0mL离心管中，液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎，然后加入60μL提取液A，并用另外60μL A液清洗牙签；(3)65℃水浴45min，每隔15min混匀一次；(4)加入120μL提取液B，混匀后冰浴1～2h；(5)10 000×g离心15min，将上清液转移到另一个灭菌离心管中；(6)10 000×g离心10min，加入480μL预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置1～2h；(7)10 000×g离心15min，倾尽上清液，收集沉淀，用70％(mL/mL)乙醇清洗1次；重复步骤(7)，37℃晾干或冷冻干燥沉淀，获得单头褐飞虱基因组DNA，加入50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用；3)反应体系25μL：2.5μL 10×Buffer，1.25 U Ex-Taq DNA polymerase，2.5μL单头褐飞虱基因组DNA，dNTPs各0.2mmol/L，MgCl2 1mmol/L，引物各1μmol/L，加双蒸水至反应总体积为25μL；4)PCR反应程序：94℃3min，20循环：94℃30s，67-58℃30s，每2个循环降1℃，72℃1min，10循环：94℃30s，58℃30s，72℃1min，72℃5min；5)扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1％(g/mL)的琼脂糖凝胶上进行电泳，稳流80mA，1.5h后在紫外光下检测：如果存在长度分别约为900bp和370bp大小的两条带，说明个体为抗性纯合子；如果存在长度分别约为900bp和540bp大小的两条带，说明个体为敏感纯合子；如果同时存在长度分别约为900bp、540bp和370bp大小的三条带，说明个体为杂合子。