| 主权项 |
1.一种具有能增加胺基酸序列表现的哺乳类细胞株之制造方法,该方法包括:(a)将第一载体导入寄主细胞中,该第一载体包括与编码该胺基酸序列之片段操纵联结的第一选择序列,(b)于有益于选择出该第一载体的生长条件下培养寄主细胞,及将细胞生长于含有至少一种用以筛选第一选择序列之药物的选择性培养基中,(c)分离出可在第一表现量表现胺基酸序列之细胞(第一高表现细胞),(d)将编码该胺基酸序列之第二载体导入在第一表现量表现的细胞中,及将第四载体导入该细胞中,其中该第四载体进一步包括编码选择性细胞表面标记的序列,其中选择性细胞表面标记系细胞表面受体、醣蛋白、碳水化合物、蛋白质、脂蛋白、主要组织相容性(MHC/HLA)复合物、抗体、抗原;或其功能性片段者,(e)使细胞接受有益于在比该第一表现量更高的第二表现量表现胺基酸序列的条件,(f)分离出在第二表现量表现胺基酸序列的细胞以制造细胞株(第二高表现细胞),此分离系进一步包括选择表现细胞表面标记之细胞。2.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该方法进一步包括:(g)将编码该胺基酸序列之第三载体导入该在第二表现量表现的细胞中,及将第五载体导入该细胞中,使该细胞接受有益于在比该第二表现量更高的第三表现量表现胺基酸序列的条件,其中该第五载体进一步包括编码选择性细胞表面标记的序列,其中选择性细胞表面标记系细胞表面受体、醣蛋白、碳水化合物、蛋白质、脂蛋白、主要组织相容性(MHC/HLA)复合物、抗体、抗原;或其功能性片段者;及(h)分离出在第三表现量表现该胺基酸序列的细胞以制造细胞株(第三高表现细胞)。3.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该方法进一步包括将编码该胺基酸序列之载体导入该第三高表现细胞中,及使该细胞接受有益于在比该第三表现量更高的表现量表现胺基酸序列的条件下,重覆该导入载体与该接受条件步骤至少一次,以分离出在比该第三高表现细胞更高表现量的表现胺基酸序列高的细胞株。4.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该第四载体进一步包括第二选择序列。5.如申请专利范围第4项之制造方法,其中该第四载体进一步包括与编码该胺基酸序列之片段操纵联结的第二选择序列。6.如申请专利范围第4项之制造方法,其中该方法进一步包括将细胞生长于含有至少一种用以筛选第二选择序列之药物的选择性培养基中。7.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该选择性细胞表面标记系操纵联结于编码该胺基酸序列之片段。8.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该方法进一步包括以层析、掏盘细胞洗选法、流式细胞光度术、免疫沈淀或抗体结合方法之至少一种方法分离出可表现细胞表面标记之细胞。9.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该第五载体进一步包括第三选择序列。10.如申请专利范围第9项之制造方法,其中该第三选择序列系操纵联结于编码该胺基酸序列之片段。11.如申请专利范围第9项之制造方法,其中该方法进一步包括将细胞生长于含有至少一种用以筛选第三选择序列之药物的选择性培养基中。12.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该选择性细胞表面标记系操纵联结于编码胺基酸序列之片段。13.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该方法进一步包括以层析、掏盘细胞洗选法、流式细胞光度术、免疫沈淀或抗体结合方法之至少一种方法分离出可表现细胞表面标记之细胞。14.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该第二高表现细胞之胺基酸序列表现量以抗体反应性决定,表现出相对于该第一高表现细胞为3倍至40倍之胺基酸序列表现量。15.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该第三高表现细胞之胺基酸序列表现量以抗体反应性决定,系表现出相对于该第二高表现细胞之3倍至40倍者。16.如申请专利范围第1项之制造方法,其中该胺基酸序列系编码免疫球蛋白之重链至轻链或其官能性片段者。17.如申请专利范围第2项之制造方法,其中该载体可各自分别编码第一抗药基因、细胞表面标记、或第二抗药基因,及各该载体系进一步操纵联结于胺基酸序列。18.如申请专利范围第1项之制造方法,其中之选择性细胞表面糖蛋白标记系CD(分化群组)醣蛋白者。19.如申请专利范围第1项之制造方法,其中之药物系氨基糖抗生素(G418)、潮霉素B(hmb)、嘌吟霉素或新霉素者。20.如申请专利范围第1项之制造方法,其中第一或第二载体至少有一个导入细胞中之次数系于2至20次之间者。21.如申请专利范围第2项之制造方法,其中第三载体导入细胞中之次数系于2至20次之间者。22.如申请专利范围第1项之制造方法,其中之细胞表面标记系由第一载体及第二载体之至少一种编码者。23.如申请专利范围第2项之制造方法,其中之第三载体系另外包括编码选择性细胞表面标记之序列者。24.如申请专利范围第1项之制造方法,其中之胺基酸序列系编码免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链或其功能性片段者。图式简单说明:第1A图及第1B图为本发明所使用之载体说明图示。第1A图中为载体pJAIgG4TF系编码嵌合式抗组织因子(TF)重链与轻链免疫球蛋白。第1B图为载体pDRHK系编码与人类免疫球蛋白k常数区融合之单链HLA-DR2/MBP分子。第2图为于T25组织培养瓶静态培养下高量制造的重组嵌合式抗-TF抗体之图示。该可制造高量抗-TF抗体之重组细胞株系经连续三次转染后分离。此高产量重组细胞株分别命名为H9G12、3D2A9及A11B5。第3图为于生物反应器中高量制造重组嵌合式抗-TF之图示。可制造高量抗-TF抗体之重组细胞株,系经连续三次转染后分离。第一次及第三次转染后分离之高产量重组细胞株分别命名为H9G12及A11B5。第4图为于T25组织培养瓶静态培养下高量制造的重组sc-DR2/MBP-C之图示。可制造高量sc-DR2/MBP-C融合蛋白之重组细胞株经连续三次转染后分离。此高产量重组细胞株分别命名为A5B4、DR2H4及B9。 |
