抗菌肽毕赤酵母的制备与应用

摘要

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。根据天然抗菌肽A的1-11位氨基酸序列及抗菌肽D的12-37位氨基酸序列，设计抗菌肽AD基因，克隆于毕赤酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件，在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)。将抗菌肽酵母制品按5000单位/kg添加于仔猪饲料中，或以60-100单位/日·头添加于雏鸡饮水中，能预防与治疗禽畜腹泻，可代替部分抗生素作为饲料添加剂。

主权项

1、抗菌肽毕赤酵母的制备，其特征在于：根据柞蚕天然抗菌肽设计抗菌肽AD氨基酸序列：将第1-11位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽A序列，将第12-37位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽D序列；用DNA合成仪合成含82个碱基的F₁多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F₂多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；设计合成引物1：5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′        引物2：3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F₁、F₂和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCR^TM2.1质粒(T载体)用T₄DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM103，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒pCRCAD的转化子；采用点突变方法，使第37位的赖氨酸(AAG)改造成天门冬酰胺(AAC)；设计合成引物A、B：引物A：5′ GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG 3′引物B：3′ CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD质粒为模板加入引物A及B，PCR扩增得到改造后的抗菌肽基因命名为抗菌肽CAD，其DNA序列是：                    M    K    W    K    L    F    K    K    I    E    K5′ GAG  CTC  GAG  ATG  AAA  TGG  AAG  TTG  TTC  AAA  AAG  ATT  CAA  AAG3′ CTC  GAG  CTC  TAC  TTT  ACC  TTC  AAC  AAG  TTT  TTC  TAA  GTT  TTC                    K    V    G    Q    R    V    R    D    A    V    I                   AAG  GTT  GGT  CAA  AGA  GTT  AGA  GAC  GCT  GTC  ATC                   TTC  CAA  CCA  GTT  TCT  CAA  TCT  CTG  CGA  CAG  GTT                    S    A    G    P    A    V    A    T    V    A    Q                   TCT  GCT  GGT  GCT  GCT  GTT  GCC  ACT  GTT  GCT  CAA                   AGA  CGA  CCA  CGA  CGA  CAA  CGG  TGA  CAA  CGA  GTT                    A    T    A    L    A    N                   GCT  ACT  GCC TTG  GCT  AAC TAA  GAA TTC  GGC  GGC 3′                   CGA  TGA  CGG  AAC  CGA TTG  ATT  CTT  AAG  CCG  CCG 5′以抗菌肽CAD基因与pHIL-S1质粒重组转化于大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素抗性基因筛选到转化子pHIL-CAD5，测序结果为141碱基对(bp)；将抗菌肽CAD基因与载体质粒pPICZ α-A重组，克隆于大肠杆菌TOP10，以Zerocin抗性基因筛选得含重组质粒pCAD5的转化子；用锂盐法将重组质粒pCAD5转入毕赤酵母中表达，获得抗菌肽CAD毕赤酵母工程菌GSCAD5；将含抗菌肽CAD的毕赤酵母GSCAD5菌株在培养基中摇瓶培养作为菌种：将菌种接入盛有培养基的发酵罐中发酵培养，培养24小时后，取样检测菌体密度达6OD以上时加入95％甲醇，甲醇加入量1％(占发酵液总量)诱导产生抗菌肽，继续培养72小时后，抽样检测菌体密度达10 OD以上后，通入100℃蒸汽，20-30分钟，放料，发酵液离心，除去菌体，滤液浓缩到原体积的1/10，将浓缩液冻成干粉，即为抗菌肽毕赤酵母制品。