利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法

摘要

本发明公开了通过复合竞争性逆转录酶-聚合酶链反应定量测定基因表达的方法及仪器。该方法和仪器特别适用于细胞和组织的小样品分析。

主权项

1.一种定量测定靶基因的基因表达的方法，它包括：(a)分离靶基因和持家基因的细胞mRNA，其经逆转录并在竞争性模板存在下被特异性扩增，得到各靶基因与各持家基因之比，将该比值用于估计各靶基因的基因表达量，方法是通过进行如下混合物的同时聚合酶链反应扩增，混合物中含有下列成分：i)各靶基因的至少一个寡核苷酸引物对，ii)各持家基因的至少一个寡核苷酸引物对，iii)各靶基因的至少一个突变的竞争性模板，iv)各持家基因的至少一个突变的竞争性模板，及v)含有各靶基因cDNA的至少一个拷贝，和各持家基因cDNA的至少一个拷贝的天然cDNA；经扩增以形成聚合酶链反应cDNA产物，其中含有：各靶基因与各持家基因的天然cDNA，和各靶基因与各持家基因的突变的cDNA；PCR反应混合物中含有适量的不同靶基因的竞争性模板混合物各竞争性模板之间的浓度已知，还含有相对于靶基因定量的不同的持家基因，从而使被评估的靶基因与持家基因的天然和竞争性模板通过下列扩增而测得，方法是：i)制备足够的含有cDNA等份、竞争性模板混合物、各种dNTP、热稳定的DNA聚合酶和相应于待测基因数目的缓冲液的母混合物；ii)将反应混合物的等分样品加入到置于冰上的反应容器中，反应容器的数目相应于待测基因的数目，和iii)将待测基因的特异性引物的等分样品加入到各反应容器中，并将持家基因的引物加入一个单独的管中，(b)分离cDNA产物；(c)通过将编码各靶基因的天然cDNA的量和编码靶基因竞争性模板的突变的cDNA的量，与编码各持家基因的天然cDNA的量和编码持家基因竞争性模板的突变的cDNA的量相比较，检测天然cDNA产物和突变cDNA产物的相关存在量，其中比较靶基因与持家基因的天然cDNA产物和突变cDNA产物的量的相关存在量，提供了定量测定靶基因表达的方法；以及，(d)测定相应于天然基因的PCR产物的谱带密度与相应于各基因的竞争性模板的PCR产物的谱带密度之比；其中，对于各个基因，将靶基因的天然/竞争性模板的密度比除以持家基因的天然/竞争性模板的密度比，得到单位为mRNA/106β-肌动蛋白mRNA的最终值。