用基于转录的扩增来扩增和检测HBVDNA的方法

摘要

本发明提供基于转录的扩增目标HBV核酸序列的方法，该方法从可选存在于样品中的HBV DNA开始，其包括下列步骤：在扩增缓冲液中温育怀疑含有HBV的样品，该温育体系中含有一种或多种能够在选择出的限制位点切割HBV DNA的限制性内切酶，该限制性内切酶形成指定的此HBV DNA链的3′末端；该温育体系中含有启动子引物，该启动子引物具有包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列的5′区域和与指定的DNA链的3′末端互补的3′区域；该温育体系中含有第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有该目标序列的5′末端；且在HBV ssDNA作为目标序列的情况下，该温育体系中含有限制性引物；将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性内切酶的消化；将如此获得的样品以一定的温度和时间进行加热处理，该温度和时间足以失活限制性内切酶和/或至少部分地导致双链的单链化；向样品中加入下列试剂，具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA酶H活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶；和将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。

主权项

1.基于转录的扩增目标HBV核酸序列的方法，该方法从可选存在于样品中的HBV DNA开始，其包括下列步骤：-在扩增缓冲液中温育疑似含有HBV的样品，该温育体系中含有一或多种能够在所选限制位点切割该HBV DNA的限制性内切酶，该限制性内切酶在该HBV DNA链上形成指定的3′末端；启动子引物，该启动子引物的5′区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3′区域与该DNA链的指定的3′末端互补；第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有该目标序列的5′末端；以及在HBV ssDNA作为目标序列的情况下，含有限制性引物；-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性内切酶的消化；-将如此获得的样品以足以失活限制性内切酶和/或至少部分地导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；-向样品中加入下列试剂，具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。