| 主权项 |
1.一种经分离之聚核酸分子,其系由阿弗链霉菌 的完整aveC开放编阅区(ORF)所构成,该聚核酸分子 缺乏定位在阿弗链霉菌染色体上之aveC ORF原位下 游之下一个完整的ORF,且该ORF具有SEQ ID NO:1之核 酸序列。2.如申请专利范围第1项之经分离之聚核 酸分子,其进一步与位在阿弗链霉菌aveC基因原 位上天然两侧的核酸序列连接。3.一种经分离 之聚核酸分子,其系由源自吸湿链霉菌之SEQ ID NO :3之核酸序列所构成。4.一种寡核酸分子,其 在高度严格条件下可杂交具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 之核酸序列的聚核酸分子,或杂交具有互补于 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3之核酸序列的核酸序列之 聚核酸分子,该高度严格条件系于35至65℃之温 度下,利用6SSC/0.5%焦磷酸钠进行冲洗。5.如申请专 利范围第4项之寡核酸分子,其系互补于SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:3的核酸序列,或互补于具有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3之核酸序列呈互补之核酸序列的 聚核酸分子。6.一种重组载体,其包含申请专利 范围第1项之经分离之聚核酸分子。7.如申请专 利范围第6项之重组载体,其进一步包含编码一个 或多个调节元件的核酸序列,该编码调节元件的 核酸序列系操作性连接至申请专利范围第6项之 载体的聚核酸分子之核酸序列。8.如申请专 利范围第7项之重组载体,其进一步包含编码可筛 选记号的核酸序列。9.如申请专利范围第8项之 重组载体,其是质体pSE186(CCRC 940239)。10.一种阿弗 链霉菌宿主细胞,其包含申请专利范围第8项之重 组载体。11.一种重组载体,其包含申请专利范围第 3项之经分离之聚核酸分子。12.如申请专利范围 第11项之重组载体,其进一步包含编码一个或多个 调节元件的核酸序列,该编码调节元件的核酸 序列系操作性连接至申请专利范围第11项之载体 的聚核酸分子之核酸序列。13.如申请专利范 围第12项之重组载体,其进一步包含编码可筛选记 号的核酸序列。14.一种吸湿链霉菌宿主细胞,其 包含申请专利范围第13项之重组载体。15.一种经 重组表现之阿弗链霉菌AveC基因产物,其具有由质 体pSE186(CCRC 940239)中编码阿弗链霉菌AveC基因产物 之核酸序列所编码的胺基酸序列,或SEQ ID NO:2的 胺基酸序列。16.一种经重组表现之吸湿链霉菌AveC 基因产物,其具有SEQ ID NO:4的胺基酸序列。17.一种 用于制造阿弗链霉菌之重组AveC基因产物之方法, 其包含培养经重组表现载体转形之阿弗链霉菌宿 主细胞,该重组表现载体包含聚核酸分子,该聚 核酸分子具有编码SEQ ID NO:2之胺基酸序列的核 酸序列,该聚核酸分子系操作性连接至一个或 多个调节元件,该调节元件控制该聚核酸分子在 有助于制造重组AveC基因产物的条件下在该宿主细 胞内之表现,并自该细胞培养基中回收该AveC基因 产物。18.一种用于制造吸湿链霉菌之重组AveC基因 产物之方法,其包含培养经重组表现载体转形之吸 湿链霉菌宿主细胞,该重组表现载体包含聚核酸 分子,该聚核酸分子具有编码SEQ ID NO:4之胺基酸 序列的核酸序列,该聚核酸分子系操作性连接 至一个或多个调节元件,该调节元件控制该聚核 酸分子在有助于制造重组AveC基因产物的条件下在 该宿主细胞内之表现,并自该细胞培养基中回收该 AveC基因产物。19.一种聚核酸分子,其系由与质 体pSE186(CCRC 940239)中编码阿弗链霉菌AveC基因产物 的序列相同之核酸序列,或与SEQ ID NO:1之阿弗链 霉菌aveC ORF之核酸序列相同的核酸序列所构 成,但是该核酸序列进一步包含一个或多个突变 ,该突变系选自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残基 139的Ala之核酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编码 AveC基因产物之胺基酸残基138的Ser之核酸经取代 为编码Thr之核酸,(3)插入异源核酸序列,(4)删 除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471之核酸C 之后,导入1个移位突变,(6)在编码AveC基因产物之胺 基酸残基116的核酸位置导入1个中止密码子,或(7 )编码AveC基因产物之胺基酸残基256和275的Gly和Tyr 之核酸分别经取代为编码Asp和His之核酸,以致 于其中野生型aveC对等基因已经去活化且表现包含 该突变之核酸序列之聚核酸分子的阿弗链霉 菌菌株ATCC 53692细胞产制比只表现野生型aveC对等 基因的阿弗链霉菌菌株ATCC 53692细胞降低之环己基 B2:环己基B1阿弗链霉素的比例。20.如申请专利范 围第19项之聚核酸分子,其中环己基B2:环己基B1 阿弗链霉素的降低比例系低于1.6:1。21.如申请专 利范围第20项之聚核酸分子,其中环己基B2:环己 基B1阿弗链霉素的降低比例系0.94:1。22.如申请专 利范围第20项之聚核酸分子,其中环己基B2:环己 基B1阿弗链霉素的降低比例系0.88:1。23.如申请专 利范围第20项之聚核酸分子,其中环己基B2:环己 基B1阿弗链霉素的降低比例系0.84:1。24.一种聚核 酸分子,其系由强力启动子以操作性连接SEQ ID NO :1之阿弗链霉菌aveC ORF所构成。25.如申请专利范围 第24项之聚核酸分子,其中该强力启动子是来自 红糖多孢菌的ermE启动子。26.如申请专利范围第19 项之聚核酸分子,其中该移位突变是经由SEQ ID NO :1的aveC ORF之第471位置之C核酸之后加入两个G核 酸。27.一种重组载体,其包含申请专利范围第19 至26项中任一项之聚核酸分子。28.一种重组载 体,其是pSE180(CCRC 940235)。29.一种链霉菌宿主细胞, 其包含申请专利范围第28项之重组载体。30.一种 用于监定能降低所制造之种类2:1比例的阿弗链霉 素之aveC ORF的突变之方法,其包含(a)决定经由天然 aveC对等基因已去活性的阿弗链霉菌细胞所制造之 种类2:1比例的阿弗链霉素,且导入并表现含有编码 突变AveC基因产物之核酸序列的聚核酸分子,(b )决定经由相同于步骤(a)的阿弗链霉菌菌株但只表 现SEQ ID NO:1的ORF之核酸序列的aveC对等基因之细 胞所制造的种类2:1比例的阿弗链霉素,以及(c)比较 经由步骤(a)中的阿弗链霉菌细胞所制造的种类2:1 比例之阿弗链霉素,与经由步骤(b)中的阿弗链霉菌 细胞所制造的种类2:1比例之阿弗链霉素,如果步骤 (a)之阿弗链霉菌所制造的种类2:1比例之阿弗链霉 素系低于步骤(b)之阿弗链霉菌所制造的种类2:1比 例之阿弗链霉素,则已监定出能改变种类2:1比例之 阿弗链霉素之aveC ORF的突变。31.一种用于监定能 改变所制造之阿弗链霉素之数量的突变aveC ORF或 含有aveC ORF的基因构筑体之方法,其包括(a)决定经 由天然aveC对等基因已去活性的阿弗链霉菌细胞所 制造的阿弗链霉素数量,且导入并表现含有编码突 变AveC基因产物或含有编码AveC基因产物之基因构 筑体之核酸序列的聚核酸分子,(b)决定经由相 同于步骤(a)的阿弗链霉菌菌株但只表现SEQ ID NO:1 的aveC对等基因之核酸序列的细胞所制造的阿弗 链霉素数量,以及(c)比较经由步骤(a)中的阿弗链霉 菌细胞所制造的阿弗链霉素数量,与经由步骤(b)中 的阿弗链霉菌细胞所制造的阿弗链霉素数量,如果 步骤(a)之阿弗链霉菌与步骤(b)之阿弗链霉菌所制 造的阿弗链霉素数量不同,则已监定出能改变阿弗 链霉素之制造数量的突变aveC ORF或基因构筑体。32 .一种用于制造新颖的阿弗链霉菌菌株之方法,该 菌株包括表现已突变aveC对等基因的阿弗链霉菌菌 株和此相同菌株但与只表现野生型aveC对等基因之 细胞比较时可制造降低之种类2:1阿弗链霉素比例 之菌株,该方法包括利用带有突变aveC对等基因之 载体转形阿弗链霉菌菌株,其中与此相同菌株但只 表现野生型aveC对等基因之细胞比较时,该突变aveC 对等基因所编码的基因产物可降低种类2:1阿弗链 霉素的制造比例,并筛选此已转形之细胞,其中该 aveC对等基因中之突变系一个或多个突变,该突变 系选自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残基139的Ala之 核酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编码AveC基因 产物之胺基酸残基138的Ser之核酸经取代为编码 Thr之核酸,(3)插入异源核酸序列,(4)删除640bp之 PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471之核酸C之后,导 入1个移位突变,(6)在编码AveC基因产物之胺基酸残 基116的核酸位置导入1个中止密码子,或(7)编码 AveC基因产物之胺基酸残基256和275的Gly和Tyr之核 酸分别经取代为编码Asp和His之核酸。33.一种用 于制造新颖的可改变阿弗链霉素制造数量的阿弗 链霉菌菌株之方法,其包括利用带有表现已突变 aveC对等基因或含有此aveC对等基因之基因构筑体 之载体转形阿弗链霉菌菌株,其中与此相同菌株但 只表现野生型aveC对等基因之细胞比较时,该已突 变aveC对等基因之表现,可改变阿弗链霉素的制造 数量,及筛选此能改变阿弗链霉素之制造数量的已 转形之细胞,其中该aveC对等基因中之突变系一个 或多个突变,该突变系选自(1)编码AveC基因产物之 胺基酸残基139的Ala之核酸经取代为编码Thr之核 酸,(2)编码AveC基因产物之胺基酸残基138的Ser之 核酸经取代为编码Thr之核酸,(3)插入异源核 酸序列,(4)删除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸位置 471之核酸C之后,导入1个移位突变,(6)在编码AveC 基因产物之胺基酸残基116的核酸位置导入1个中 止密码子,或(7)编码AveC基因产物之胺基酸残基256 和275的Gly和Tyr之核酸分别经取代为编码Asp和His 之核酸。34.一种用于制造含有已去活性的aveC对 等基因的新颖阿弗链霉菌菌株之方法,包括利用含 有已去活性之aveC对等基因的载体转形阿弗链霉菌 菌株细胞,及筛选此aveC对等基因已去活性的已转 形之细胞,其中该aveC对等基因中之突变系一个或 多个突变,该突变系选自(1)编码AveC基因产物之胺 基酸残基139的Ala之核酸经取代为编码Thr之核 酸,(2)编码AveC基因产物之胺基酸残基138的Ser之核 酸经取代为编码Thr之核酸,(3)插入异源核酸 序列,(4)删除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471 之核酸C之后,导入1个移位突变,(6)在编码AveC基 因产物之胺基酸残基116的核酸位置导入1个中止 密码子,或(7)编码AveC基因产物之胺基酸残基256和 275的Gly和Tyr之核酸分别经取代为编码Asp和His之 核酸。35.如申请专利范围第34项之方法,其中的 载体是pSE180(CCRC 940235)。36.一种阿弗链霉菌菌株, 包括表现已突变aveC对等基因的阿弗链霉菌菌株, 该菌株与此相同菌株但只表现野生型aveC对等基因 之细胞比较时可降低种类2:1阿弗链霉素的制造比 例,其中该aveC对等基因中之突变系一个或多个突 变,该突变系选自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残 基139的Ala之核酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编 码AveC基因产物之胺基酸残基138的Ser之核酸经取 代为编码Thr之核酸,(3)插入异源核酸序列,(4) 删除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471之核 酸C之后,导入1个移位突变,(6)在编码AveC基因产物 之胺基酸残基116的核酸位置导入1个中止密码子 ,或(7)编码AveC基因产物之胺基酸残基256和275的Gly 和Tyr之核酸分别经取代为编码Asp和His之核酸 。37.如申请专利范围第36项之菌株,其中之细胞所 制造的环己基B2:环己基B1阿弗链霉素的比例少于1. 6:1。38.如申请专利范围第37项之菌株,其中之细胞 所制造的环己基B2:环己基B1阿弗链霉素的比例系0. 94:1。39.如申请专利范围第37项之菌株,其中之细胞 所制造的环己基B2:环己基B1阿弗链霉素的比例系0. 88:1。40.如申请专利范围第37项之菌株,其中之细胞 所制造的环己基B2:环己基B1阿弗链霉素的比例系0. 84:1。41.一种阿弗链霉菌菌株,包括表现已突变aveC 对等基因或基因构筑体的阿弗链霉菌菌株,该菌株 与此相同菌株但只表现野生型aveC对等基因之细胞 比较时,可增加阿弗链霉素的制造数量,其中该aveC 对等基因中之突变系一个或多个突变,该突变系选 自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残基139的Ala之核 酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编码AveC基因产物 之胺基酸残基138的Ser之核酸经取代为编码Thr之 核酸,(3)插入异源核酸序列,(4)删除640bp之PstI/ SphI片段,(5)在核酸位置471之核酸C之后,导入1 个移位突变,(6)在编码AveC基因产物之胺基酸残基 116的核酸位置导入1个中止密码子,或(7)编码AveC 基因产物之胺基酸残基256和275的Gly和Tyr之核酸 分别经取代为编码Asp和His之核酸。42.如申请专 利范围第41项之菌株,其中该aveC基因已经去活性。 43.一种用于制造阿弗链霉素之方法,包括于培养基 中在许可或引发制造阿弗链霉素的条件下培养阿 弗链霉菌菌株,此菌株表现编码基因产物之突变 aveC对等基因,该菌株与此相同菌株但只表现野生 型aveC对等基因之细胞比较时,可降低种类2:1阿弗 链霉素的制造比例,及自此培养液中回收阿弗链霉 素,其中该aveC对等基因中之突变系一个或多个突 变,该突变系选自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残 基139的Ala之核酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编 码AveC基因产物之胺基酸残基138的Ser之核酸经取 代为编码Thr之核酸,(3)插入异源核酸序列,(4) 删除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471之核 酸C之后,导入1个移位突变,(6)在编码AveC基因产物 之胺基酸残基116的核酸位置导入1个中止密码子 ,或(7)编码AveC基因产物之胺基酸残基256和275的Gly 和Tyr之核酸分别经取代为编码Asp和His之核酸 。44.一种用于制造阿弗链霉素之方法,包括于培养 基中在许可或引发制造阿弗链霉素的条件下培养 此阿弗链霉菌菌株,此菌株表现突变aveC对等基因 或含有此aveC对等基因之基因构筑,该菌株与此相 同菌株但只表现野生型aveC对等基因之细胞比较时 ,可改变阿弗链霉素的制造数量,及自此培养液中 回收阿弗链霉素,其中该aveC对等基因中之突变系 一个或多个突变,该突变系选自(1)编码AveC基因产 物之胺基酸残基139的Ala之核酸经取代为编码Thr 之核酸,(2)编码AveC基因产物之胺基酸残基138的 Ser之核酸经取代为编码Thr之核酸,(3)插入异源 核酸序列,(4)删除640bp之PstI/SphI片段,(5)在核酸 位置471之核酸C之后,导入1个移位突变,(6)在编码 AveC基因产物之胺基酸残基116的核酸位置导入1 个中止密码子,或(7)编码AveC基因产物之胺基酸残 基256和275的Gly和Tyr之核酸分别经取代为编码Asp 和His之核酸。45.如申请专利范围第44项之方法, 其中阿弗链霉素的制造数量可经由表现突变的aveC 对等基因或基因构筑而增加。46.一种阿弗链霉素 之组成物,该阿弗链霉素系经由阿弗链霉菌菌株所 制造,此菌株表现一突变的aveC对等基因,其所编码 的基因产物可降低种类2:1阿弗链霉素的制造比例, 此表现已突变aveC对等基因的阿弗链霉菌菌株与此 相同菌株但只表现野生型aveC对等基因之细胞比较 时,可降低种类2:1阿弗链霉素的制造比例,其中该 aveC对等基因中之突变系一个或多个突变,该突变 系选自(1)编码AveC基因产物之胺基酸残基139的Ala之 核酸经取代为编码Thr之核酸,(2)编码AveC基因 产物之胺基酸残基138的Ser之核酸经取代为编码 Thr之核酸,(3)插入异源核酸序列,(4)删除640bp之 PstI/SphI片段,(5)在核酸位置471之核酸C之后,导 入1个移位突变,(6)在编码AveC基因产物之胺基酸残 基116的核酸位置导入1个中止密码子,或(7)编码 AveC基因产物之胺基酸残基256和275的Gly和Tyr之核 酸分别经取代为编码Asp和His之核酸。图式简单 说明: 图1.包含阿弗链霉菌aveC开放编阅区的DNA序列(SEQ ID NO:1),以及所推论的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。 图2.包含阿弗链霉菌aveC基因的完整开放编阅区的 质体载体pSE186(ATCC 209604) 图3.包含将红糖多孢菌(Sacch-aropolyspora erythraea)ermE 基因插入到阿弗链霉菌aveC开放编阅区的基因置换 载体pSE180(ATCC 209605)。 图4.阿弗链霉菌的阿弗链霉素聚酮酸合成基因 群集的五个已监定之重复黏接质体(pSE65,pSE66,pSE67, pSE68,pSE69)的BamHI限制图舆。而pSE118和pSE119的关 系也指出。 图5.经由阿弗链霉菌所制造的醱酵产物之高压液 相色层分析法(HPLC)。定量尖峰是与标准环己B1比 较得知。环己B2保留时间是7.4-7.7分钟,环己B1保留 时间是11.9-12.3分钟。 图5A.阿弗链霉菌菌株SE180-11具有一去活化aveC开放 编阅区。图5B.以PSE186(ATCC 209604)转形的阿弗链霉菌 菌株SE180-11。图5C.以pSE187转形的阿弗链霉菌菌株SE 180-11。图5D.以pSE188转形的阿弗链霉菌菌株SE180-11 。 图6.比较编码aveC开放编阅区之各推论的胺基酸序 列,包括比较阿弗链霉菌(SEQ ID NO:2),来自灰色链霉 菌(S.griseochromogenes)(SEQ ID NO:5)的aveC同质性部分开 放编阅区,和来自吸湿链霉菌的aveC同质性部分开 放编阅区(SEQ ID NO:4)。粗体字缬胺酸残基推测的蛋 白质启始位置。若是3个序列皆同质者以大写字表 示,若3个中只有2个同质则以较低之小写表示。结 果得知胺基酸序列约50%序列相同。 图7.融合之质体构筑,包括将灰色链霉菌aveC同质基 因的564bp BsaAI/KpnI片断插入到阿弗链霉菌aveC开放 编阅区的BsaAI/KpnI位置。 |
