| 主权项 |
1.一种用以生成一DNA建构物的方法,该DNA建构物可 用于生成一经修饰的牛痘病毒安哥拉株(MVA)重组 型病毒,该MVA重组型病毒包含并可表现被插入于MVA 的基因组内的一个天然发生的删除位置Ⅱ处之一 或一种以上的外来基因,该方法包含的步骤为:将 一个含有一或一种以上的外来基因的DNA序列插入 至位在MVA基因组内的一个天然发生的删除位置Ⅱ 之侧翼的序列之间。2.如申请专利范围第1项之方 法,其中被包含于该DNA序列中的该外来基因编码一 标记、一治疗剂、一抗原或一抗原决定位。3.如 申请专利范围第2项之方法,其中被包含于该DNA序 列中的该外来基因编码一源自下列之抗原或抗原 决定位:病源性病毒、细菌或其他微生物,寄生虫 或肿瘤细胞。4.如申请专利范围第3项之方法,其中 被包含于该DNA序列中的该外来基因编码一源自下 列之抗原或抗原决定位:恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、分枝杆菌(Mycobacteria)、疹病毒(Herpes virus)、流感病毒(influenza virus)、肝炎病毒(hepatitis virus)或人类免疫不全病毒(human immunodeficiency virus) 。5.如申请专利范围第3项之方法,其中该抗原或抗 原决定位是HIV nef或人类酪胺酸。6.如申请专利 范围第1项之方法,其中被包含于该DNA序列中的该 外来基因系处在牛痘病毒的早期/晚期启动子P7.5 的转录控制下。7.如申请专利范围第1项之方法,其 中被包含于该DNA序列中的该外来基因编码T7 RNA聚 合。8.一种用以生成一载体质体的方法,该载体 质体可用于生成一MVA重组型病毒,该MVA重组型病毒 包含并可表现被插入于MVA的基因组内的天然发生 的删除位置Ⅱ处之一或一种以上的外来基因,该方 法包含的步骤为:将位在MVA基因组内之一个天然发 生的删除位置Ⅱ的左侧与右侧的MVA DNA侧翼序列选 殖至一质体中,以及将一含有一或一种以上的外来 基因的DNA序列插入至该质体内居于该左侧及该右 侧MVA DNA侧翼序列之间。9.如申请专利范围第8项之 方法,其中被包含于该DNA序列中的该外来基因编码 一标记、一治疗剂、一抗原或抗原决定位。10.如 申请专利范围第9项之方法,其中被包含于该DNA序 列中的该外来基因编码一源自下列之抗原或抗原 决定位:病源性病毒、细菌或其他微生物,寄生虫 或肿瘤细胞。11.如申请专利范围第10项之方法,其 中被包含于该DNA序列中的该外来基因编码一源自 下列之抗原或抗原决定位:恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、分枝杆菌(Mycobacteria)、疹病毒(Herpes virus)、流感病毒(influenza virus)、肝炎病毒(hepatitis virus)或人类免疫不全病毒(human immunodeficiency virus) 。12.如申请专利范围第10项之方法,其中该抗原或 抗原决定位是HIV nef基因或人类酪胺酸。13.如申 请专利范围第12项之方法,其中由此所生成的载体 质体导致MVA-LAInef或MVA-hTYR的生成。14.如申请专利 范围第8项之方法,其中被包含于该DNA序列中的该 外来基因系处在牛痘病毒的早期/晚期启动子P7.5 的转录控制下。15.如申请专利范围第8项之方法, 其中被包含于该DNA序列中的该外来基因编码T7 RNA 聚合。16.如申请专利范围第15项之方法,其中由 此所生成的载体质体导致MVA-T7 pol的生成。17.一种 用以生成一MVA重组型基因组/病毒的方法,该MVA重 组型基因组/病毒包含并可表现被插入于MVA的基因 组内的一个天然发生的删除位置Ⅱ处之一或一种 以上的外来基因,该方法包括下列步骤: (a)以一MVA来感染一禽类宿主细胞; (b)以一藉由申请专利范围第8项的方法所制备的载 体质体来穿染该被感染的禽类宿主细胞; (c)进行该载体质体与该MVA的DNA基因组之间的同源 性重组;以及 (d)分离所形成的MVA重组型基因组/病毒; 其中感染步骤(a)与穿染步骤(b)被同时地或是在有 一合适之时间差下被进行。18.如申请专利范围第 17项之方法,其中所形成的MVA重组型基因组/病毒是 MVA-LAInef、MVA-hTYR或MVA-T7pol。19.如申请专利范围第 17项之方法,其中位于所形成的MVA重组型基因组/病 毒中之该外来基因是在牛痘病毒的早期/晚期启动 子P7.5的转录控制下。20.如申请专利范围第17项之 方法,其中所形成的MVA重组型基因组/病毒不含有 于人类细胞内可复制的病毒。21.一种用以制备一 疫苗的方法,其包括将依据申请专利范围第17项之 方法所制备的MVA重组型基因组/病毒与一药学上可 接受的载剂相混合。22.一种用以制备一疫苗的方 法,其包括将依据申请专利范围第18项之方法所制 备的MVA重组型基因组/病毒与一药学上可接受的载 剂相混合。23.一种用以制备一疫苗的方法,其包括 将依据申请专利范围第19项之方法所制备的MVA重 组型基因组/病毒与一药学上可接受的载剂相混合 。24.一种用以在活体外于一细胞培养物中表现一 外来基因的方法,其包括下列步骤: (i)以一藉由申请专利范围第17项之方法所生成的 MVA重组型基因组/病毒来感染禽类宿主细胞;及 (ii)培养被感染的禽类宿主细胞,藉此,该外来基因 于该被感染的禽类宿主细胞内被表现。25.如申请 专利范围第24项之方法,其中于步骤(i)中所用的MVA 重组型基因组/病毒是MVA-LAInef、MVA-hTYR或MVA-T7pol。 26.如申请专利范围第24项之方法,其中该等细胞额 外地含有一或多个表现载体携带有处于T7 RNA聚合 启动子之转录控制下的一或一种以上的外来基 因。27.如申请专利范围第26项之方法,其中该等细 胞被进一步培养,藉此,该一或一种以上的外来基 因被表现而容许分离出由该(等)外来基所编码之 多。28.如申请专利范围第24项之方法,其中该等 细胞额外地含有: a)一表现载体,其带有一反转病毒载体建构物,该反 转病毒载体建构物可感染并于标的细胞内指引一 或多个为该反转病毒载体建构物所携带的外来基 因之表现,以及 b)一或多个带有编码多胜之基因的表现载体,该 等多胜系为该反转病毒载体建构物的基因组要 在一T7 RNA聚合启动子的转录控制下被包装时所 需要者。29.如申请专利范围第28项之方法,其中该 等细胞被进一步培养,藉此,病毒粒子被生成并从 该细胞培养物被分离出。30.一种用以生产一MVA重 组型病毒之方法,该MVA重组型病毒包含并可表现被 插入于MVA的基因组内的一个天然发生的删除位置 Ⅱ处之一或一种以上的外来基因,该方法包含的步 骤为:令一MVA病毒与一质体进行重组,于该质体内 有一含有一或一种以上的外来基因的DNA序列被侧 接以MVA-DNA序列,该等MVA-DNA序列邻接于MVA基因组内 之一个天然发生的删除位置Ⅱ。31.如申请专利范 围第30项之方法,其中该重组系藉由以该质体来穿 染禽类细胞并以MVA病毒来感染该等细胞而被进行, 其中穿染及感染系同时地或在有一合适之时间差 下被进行。32.如申请专利范围第31项之方法,其中 该禽类细胞为鸡胚纤维母细胞(CEF)。33.如申请专 利范围第30项之方法,其中该外来基因编码一标记 、一治疗剂、一抗原或一抗原决定位。34.如申请 专利范围第30项之方法,其中该外来基因编码一源 自下列之抗原或抗原决定位:病源性病毒、细菌或 其他微生物,寄生虫或肿瘤细胞。35.如申请专利范 围第34项之方法,其中该外来基因编码一源自下列 之抗原或抗原决定位:恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、分枝杆菌(Mycobacteria)、疹病毒(Herpes virus)、流感病毒(influenza virus)、肝炎病毒(hepatitis virus)或人类免疫不全病毒(human immunodeficiency virus) 。36.如申请专利范围第35项之方法,其中该抗原或 抗原决定位是HIV nef或人类酪胺酸。37.如申请专 利范围第30项之方法,其中所形成的MVA重组型病毒 是MVA-LAInef或MVA-hTYR或MVA-T7 pol。38.如申请专利范围 第30项之方法,其中该外来基因编码T7 RNA聚合。 39.如申请专利范围第30项之方法,其中该外来基因 系处在牛痘病毒的早期/晚期启动子P7.5的转录控 制下。40.如申请专利范围第30项之方法,其中所形 成的MVA病重组型毒不含有于人类细胞内可复制的 病毒。41.一种用以制备一疫苗的方法,其包括将藉 由申请专利范围第30至40项中任一项之方法来制备 而形成的MVA重组型病毒与一药学上可接受的载剂 相混合。图式简单说明: 第一图:MVA的基因组以及用于藉由同源性重组来插 入外来DNA的质体之示意图:位于MVA的基因组内之 HindIII限制位址被标示于上方。其位于MVA基因组内 的删除位置II之邻接处相重叠的900-bp HindIII-HindIII N片段被显示出。与删除位置II邻接的MVA DNA序列( 侧翼1及侧翼2)藉由PCR被扩增并用于构筑插入质体 pUC II LZ。 第二图:用于插入至含有P11-LacZ表现卡匣以及牛痘 病毒早期/晚期启动子P7.5之删除位置II内之pUC II LZ P7.5:MVA载体质体,俾以表现可被殖入至该质体的 SmaI位址内之感兴趣的基因。 第三图:用于在MVA基因组内的删除位置II处插入外 来基因的pUC II LZdel P7.5:MVA载体质体,其含有一个自 我删除的P11-LacZ表现卡匣以及牛痘病毒早期/晚期 启动子P7.5,俾以表现可被殖入至该质体的Sma1/Not1 殖入位址内之感兴趣的基因。 第四图:重组型病毒MVA-T7pol之构筑:MVA基因组(HindIII 限制内切位址)以及载体质体pUC II LZ T7pol之示意 图,这容许位在删除位置II处的T7 RNA聚合基因插 入至MVA基因组之HindIII N片段内。 第五图:MVA-T7pol病毒DNA之南方墨点转印分析。 第六图:使用[35S]甲硫胺酸的蛋白质之代谢性标示 。SDS PAGE分析。第1行:MVA T7pol,第2行:MVA,第3行:CV-1 细胞。 第七图:CAT分析:被含有在T7 RNA聚合启动子的控 制下之CAT基因的质体所穿染以及被MVA-T/pol或WR-T7 pol所感染的CV-1细胞。溶胞产物就CAT活性被测试。 C代表氯霉素,而1-AcC与3-AcC代表单-及三-乙醯化形 式之氯霉素。CAT活性被表示为在60分钟内被形成 的乙醯化产物之百分比。 第八图:MVA-LAInef之构筑:MVA基因组(HindIII限制内切 位址)以及容许HIV-1 LAI之nef基因插入至MVA基因组 之HindIII N片段内的删除位置II处的载体质体pUC II LZdel P7.5-LAInef之示意图。 第九图:MVA-hTYR之构筑:MVA基因组(HindIII限制核酸内 切位址)以及容许人类酪胺酸基因插入至MVA基 因组之HindIII N片段内的删除位置II处的载体质体 pUC II Lzdel P7.5-TYR之示意图。 |
