主权项 |
1.一种端粒酶活性的定量测定方法,包括下列步骤:含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备;端粒酶介导的端粒重复序列的延伸;PCR扩增端粒酶作用产物;扩增结果的分析和利用计算公式进行定量分析,其特征在于在含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备步骤中,直接取待抽提细胞用磷酸盐缓冲液洗一次;在端粒酶介导的端粒重复序列的延伸步骤中,在TRAP缓冲液中加入无放射性的TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’]引物;在PCR扩增端粒酶作用产物的步骤中,加入反向引物、内标引物和Taq DNA聚合酶,其中反向引物为:ACX[5’-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3’],内标引物为:NT[5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’]和TSNT[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’];在扩增结果的分析步骤中,电泳结果采用荧光染料染色;在利用计算公式进行定量分析步骤中,利用公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]},其中:TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度,TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度,R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准),B为只加裂解液所得条带灰度,RI为R8的内部参照所得的条带灰度。 |