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Von der Kieselalge P. tricornutum wurde die Sequenz eines Klones, der über ESTs als homologer pflanzlicher LOXen identifiziert wurde, mittels 5'RACE erfolgreich verlängert und die Sequenz der komplexen cDNA bestimmt. Die Isolation dieser cDNA aus der zugrunde liegenden Phagen-Bank gelang nicht, weswegen die komplette cDNA-Sequenz aus zwei überlappenden Fragmenten zusammengesetzt wurde. Das eine Fragment entsprach dem vorliegenden cDNA-Klon und das andere Fragment wurde aus der cDNA-Bibliothek isoliert. Da im Bereich der Überlappung eine in der Sequenz unikale Restriktionsschnittstelle eine Endonuklease existierte, konnten diese zwei Fragmente zur vollständigen cDNA-Sequenz zusammengesetzt werden. Da die Reinigung des Enzyms nicht glückte, wurde für die biochemische Charakterisierung das ungereinigte Enzym aus den bakteriellen Zelllysaten eingesetzt. Bei der Umsetzung von Linolsäure durch PtLOX1 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser LOX um eine 13-LOX handelt. Das pH-Optimum des Enzyms wurde anhand der Umsetzung von Linolsäure bestimmt und liegt bei pH 8,2. Um aufzuklären, welche vielfach ungesättigten Fettsäuren von PtLOX1 als Substrate akzeptiert werden und welche Regioisomere dabei bevorzugt entstehen, wurden sieben verschiedene Fettsäuren eingesetzt: Linolsäure (LA), alpha-Linolensäure (alpha-LEA), gamma-Linolensäure (gamma-LEA), Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA). Die Umsetzung von LA ergab nach Reduktion ... |
