一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法

摘要

本发明是一种人工基团生产嗜热菌蛋白酶的方法。它通过构建表达载体—转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。本发明蛋白酶收率高，得到的蛋白酶活性也高，达到300－400万U/g，且生产成本低。

主权项

1、一种嗜热菌蛋白酶的生产方法，其特征在于是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶，具体步骤如下：(1)蛋白酶全长基因的克隆根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm；(2)表达载体的构建以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；其中pnmthm 1为：AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT，ptmthm3为：AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；(3)表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以异丙基硫代半乳糖苷诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。