一种快速准确鉴定杂交水稻不育系和杂交种子纯度的方法

摘要

一种快速、准确鉴定杂交水稻不育系种子和杂交种子纯度的方法。包括种子处理，DNA样品制备，聚合酶链反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色和结果观察方法。本发明的种子纯度鉴定方法与现有的种子纯度鉴定方法相比具有时间短，速度快，准确度高，成本低等优点。

主权项

1、一种快速、准确鉴定杂交水稻不育系种子和杂交种子纯度的方法，其特征在于操作步骤为：(1)种子处理：将水稻不育系或杂交种种子置于25℃条件下，浸种48小时：再转入培养皿中，32℃进行湿润催芽24小时，25℃培养3-4天；(2)DNA样品制备：分别将每粒稻谷的幼芽和嫩叶取下，剪成0.5厘米长小段，放入碾缸中，加入250ul DNA提取液，碾磨成匀浆；再加入250ul DNA提取液混匀，转入1.5ml离心管，加入体积比为24∶1氯仿/异戊醇300ul，振荡5分钟后，以3000转/分转速离心30秒，将上清液转入另一个1.5ml离心管中，加入500ul 100％冰冻乙醇混合后，静置5分钟，再离心1分钟去掉上清液，加入400ul 70％乙醇冲洗2次或/和离心20秒后，去掉乙醇、干燥，溶解于30ulTE缓冲液中待用；(3)聚合酶链反应：将2ul提取的DNA样品加入0.5ml离心管中，再加入8ul反应液后，加入半滴石蜡油，进行PCR循环反应，反应循环依次为：94℃/2分钟30秒循环1次；94℃/40秒、53℃/1分钟，72℃/1分30秒循环35次；72℃/8分钟；最后，将5ul 3倍终止反应液加入0.5ml反应离心管充分混匀，放入-20℃贮藏待用；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳：将大、小各一张的电泳玻璃用蒸馏水擦净，再用95％乙醇擦净，用新鲜配置的硅化剂均匀涂擦小块电泳玻璃，干燥5分钟后，用95％乙醇擦去多余的硅化剂；用几滴Sigma-cote均匀涂擦大块电泳玻璃，干燥5分钟；将大小两张电泳玻璃叠起，并在它们之间放入0.4mm间隙片，用宽胶带封闭形成凝胶糟，四周用大票夹夹紧；配制4％70ml变性聚丙烯酰胺凝胶：将29.4g尿素和7.0ml 5倍TBE，加热搅拌至尿素溶解，加入7.0ml40％丙烯酰胺，再用双蒸水定溶至70.0ml，放入冰中冷却；加入新配制的700ul 10％过硫酸铵和70ul TEMED快速混匀后灌胶后，立即将0.4mm塑料梳的平直边扦入胶中，深度约为7mm，放置至少4小时后，将塑料梳取出，去掉边沿的票夹和胶带，将凝胶装入电泳糟中，加入0.5倍TBE电泳液，并用电泳液冲洗凝胶顶部3--4次，再扦入0.4mm上样梳；将样品置于PCR仪中，95℃5分钟变性处理，每一样品取8.0ul加入上样孔中，在40-50V/cm下进行稳压电泳，时间1小时30分；(5)硝酸银染色：试剂准备：固定剂1500ml，其中150ml冰醋酸，150ml甲醇，1200ml蒸馏水；染色液2000ml，其中2.0g硝酸银，3.0ml 37％福尔马林，1997ml二次蒸馏水；冲洗液2000ml，其中60.0g碳酸钠，3.0ml 37％福尔马林，400ul10mg/ml硫代硫酸钠，1997ml蒸馏水；操作过程：取下电泳凝胶板，平放于桌上，抽去间隙片和上样梳，用单面刀片扦入右下角，小心用力撬起大玻璃，使之与凝胶分离，并取下大玻璃；将带有凝胶的小玻璃小心放入固定液中固定20分钟，放入蒸馏水洗涤二次，每次2分钟，转入染色液中，染色30分钟；用蒸馏水洗涤10秒钟，转入冲洗液中，冲洗5--10分钟；转入固定剂中固定5--6分钟；最后，用蒸馏水洗涤2-5分钟；(6)结果观察：将染色后的凝胶玻璃板放在荧光灯下，观察经PCR扩增的DNA染色带谱；呈现阳性反应的样品为不育系种子，阴性反应的样品为其它混杂种子；呈现双阳性反应的样品为杂交种子，单阳性反应和阴性反应的样品为其它混杂种子。