妊娠特异性β<SUB>1</SUB>糖蛋白诊断试剂的制备方法

摘要

一种妊娠特异性β₁糖蛋白诊断试剂的制备方法，是应用免疫学原理，从人胎盘提取SP₁，经两次亲和层析后获得高纯度的SP₁，制成诊断血球和扩散板，本发明的SP₁纯品为单一成份，无非特异性，并与SP₁抗血清有免疫反应，而与抗HCG、抗AFP、抗人全血清无免疫反应，应用本发明，方法简单，操作方便，性能稳定，结果准确，一般实验室均可操作，在临床上对妊娠高血压综合症、胎儿发育迟缓、死胎、过期妊娠等异常疾病的诊断有较大参考意义，是围产期监护的最佳诊断试剂。

主权项

1、一种妊娠特异性β₁糖蛋白诊断试剂的制备方法，该方法采用 如下步骤： (1)妊娠特异性β₁糖蛋白的提纯 (1.1)饱和硫酸铵盐析 正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2 倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分 钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000- 10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理 盐水透析至无NH⁺； (1.2)葡聚糖凝胶柱层析 取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3 mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液PH8.0平衡，取盐析 浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗 脱液，应用妊娠特异性β₁糖蛋白血球试剂检查各管浓度，收集妊娠 特异性β₁糖蛋白高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀， 透析至无NH⁺； (1.3)妊娠特异性β₁糖蛋白偶联琼脂糖4B亲和层析 取琼脂糖4B10-40ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰 浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值， 使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经 PH7-11的0.1mol/LNaHCO₃透析的妊娠特异性β₁糖蛋白抗体搅拌4 ℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L磷酸盐或0.5mol/LNaCl缓冲液 洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计 测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度 样品5ml加入妊娠特异性β₁糖蛋白抗体亲和层析柱1.5×20cm中， 用0.01mol/LPH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗 至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液 PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集妊娠特异性β₁糖蛋白高 浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐； (1.4)抗人全血清抗体偶联琼脂糖4B亲和层析柱制备 与妊娠特异性β₁糖蛋白抗体偶联琼脂糖4B相同，其偶联率体积 比为7.28％，将浓缩除盐妊娠特异性β₁糖蛋白样品5ml加入抗人全 血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液 PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓 缩，冻干为妊娠特异性β₁糖蛋白纯品； (2)妊娠特异性β₁糖蛋白抗血清的制备 选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5- 20天后向淋巴结周围多点注射，妊娠特异性β₁糖蛋白抗原加福氏完 全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg妊娠特异性β₁糖蛋白抗原， 以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，用双向琼脂扩散法试血效 价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清； (3)人“O”型红细胞的醛化 取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后， 配成10％体积比的醛化血球悬液； (4)妊娠特异性β₁糖蛋白抗血清致敏醛化血球 取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1- 10％体积比的血球，将妊娠特异性β₁糖蛋白免疫球蛋白分别稀释成1 -20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴 下反应0.5-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓 冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出妊 娠特异性β₁糖蛋白冻干诊断血球； (5)将妊娠特异性β₁糖蛋白冻干诊断血球用0.05mol/LNaCl、 0.05％重量比的NaN₃稀释成100、200、400倍，于56℃灭活10-40 分钟，分别加入等体积的1-4％体积比的琼脂液中，琼脂液需煮沸 10-40分钟后，冷却40-70℃时方可混合均匀铺板，琼脂厚度 3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。