无需克隆的线性表达载体构建方法

摘要

本发明涉及一种线性表达载体的构建方法，特别涉及一种无需克隆的构建线性表达载体的方法。本发明在引物设计中引入切口酶的识别序列，DNA片段扩增后，用切口酶酶切和核酸外切酶降解，形成带有突出端的待连接片段，将各片段连接得到线性表达载体。该方法能大大降低线性表达载体构建成本，使这种载体的构建方法能在科研和生产中得到广泛应用，为实现基因表达，蛋白功能研究等提供技术平台。

主权项

1.一种线性表达载体的构建方法，其步骤包括：1)设计引物：a.相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列，以及一段10-25个核苷酸长度的包含切口酶N.Bpu10I识别序列的DNA，且两引物包含切口酶N.Bpu10I的DNA序列互补。b.启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；2)分别以相应DNA片段为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；3)分别纯化步骤2得到的扩增产物，并用切口酶N.Bpu10I在DNA的一条链上形成切口；4)用核酸外切酶ExoIII降解N.Bpu10I酶切后DNA双链切口处3’→5’的单链，形成单链为突出端的待连接片段；5)将酶消化后的待连接片段混合，加入退火缓冲液，连接各片段，得到含目的基因的线性表达载体；