肝癌超抗原免疫基因治疗剂

摘要

本发明公开了一种涉及基因工程技术的肝细胞癌(肝癌)超抗原免疫基因治疗剂，其特征是：制备肝癌细胞特异性调控序列介导的超抗原分子和共刺激分子在肝癌细胞进行靶向表达的治疗剂，特异性增强癌细胞的免疫原性和与免疫效应细胞的识别作用。在体内，通过介入方式送到癌区，有效杀伤癌细胞，并可利用相关药物调控该特异性调控序列的活性来调节上述两种分子的表达，并通过该特异性调控序列调控的自身产物水平判断疗效。同时，在体外诱导自身T细胞进行过继免疫治疗，辅助体内治疗，以增强疗效、治疗转移灶和预防复发。本治疗剂具有安全、靶向、可控和灭癌高效等特点，是一种很有前景的肝癌免疫基因治疗剂。

主权项

1.肝癌超抗原免疫基因治疗剂，其特征在于：从甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA，设计特异性引物，通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列；分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列，定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点，同时从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm)；将上述片段克隆至载体pLXSN中，分别构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体；将目的基因逆转录病毒载体在病毒包装细胞系PA317、φ2中进行包装；以包装好的缺陷病毒颗粒感染人肝癌细胞，表达出SEA-B7.1融合蛋白；以视黄素、地塞米松、雌激素等药物对SEA-B7.1的表达进行调控，同时通过检测AFP水平来判断治疗效果；利用AFP特异性调控序列调控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表达，通过设计特异性引物：5’CGCAACTTAGGGACAAGT 3’CGGAAAATCATGCTGAAA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3’GGAGACCAGTTAGG AAGT，通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列，其序列如下：AFP启动子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCAFP增强子序列GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC，其特点是将所获得的调控序列置于目的基因上游，特异性调控目的基因的表达。