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1、一种菌血症检验用基因芯片的检验方法，其特征在于它包括如下步骤：1)、血样中病原菌DNA的抽提：取全血血液样品置eppendorf离心管中，加入无菌水1ml在室温下静置5分钟，离心：14000×g，5分钟，弃去900ul上清液，加入400ul含有Tris、HCL、EDTA和SDS的pH8.0的裂解缓冲液，混匀后加6ul 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，置56℃水浴中保温30分钟，之后加等体积TE溶液饱和酚试剂，强烈震荡后，于8000r/min室温离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提一次，吸取上清液，加1/10体积的甲醇纳(3mol/l)，混匀，再加等体积冰冷异丙醇，混匀后再12,000rpm，室温，离心5分钟，倾去上清液，加70％冰冷乙醇振荡洗涤一次，室温下12,000rpm，离心5分钟，倾去上清液，沉淀加50ulTE溶液溶解，置-20℃储存；2)、取第一步抽提样品，加入PCR反应体系：5ul PCR buffer，5ul MgCL2，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul dNTP，0.3ul Digoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq DNA Polymerase和16ul重蒸蒸馏水，使总反应体积为50ul；把混合好的PCR待反应物，放入PCR仪中进行PCR扩增； 引物I：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’ 引物II：5’-TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’ 引物III：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’ 引物IV：5’-TTCTCGGCATAATGATGTGA-3’PCR扩增条件：首先在94℃，变性10min；然后94℃，30sec(30sec-1min)；57℃，15 sec；72℃，40sec，这样进行5个循环；而后，94℃，30sec，64℃，40sec，这样进行25个循环的反应；最后在72℃，延伸5min；所扩增的PCR产物带有地高辛标记，在4℃保存，留待以后进行杂交；3)、病原菌的鉴定：按上述扩增出被测DNA样品的靶DNA顺序，与菌血症检验用基因芯片杂交，杂交后的芯片经抗地高辛的酶联免疫吸附检测(ELISA)，出杂交点显色图形，然后与标准菌模式图数据库中的点阵图形相比对，即可确定病原菌的类型。 |
